目的：采用3种不同的方法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)的标准菌株ATCC43300耐药突变株的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)，从而试图解释MIC漂移(MIC creep)和万古霉素耐药突变选择窗(Mutant selection window, MSW)之间的关系。体外研究万古霉素(VAN)分别与左氧氟沙星(LVX)、利福平(RFP)、磷霉素(FOM)联用降低ATCC43300的防耐药突变浓度(Mutant prevention concentration,MPC)，筛选出防耐药突变能力最强的联合方案，更好地指导临床合理用药。采用兔组织笼感染模型验证万古霉素对MRSA的MSW理论，计算出体内能够抑制耐药突变体的选择及富集相关的基于MIC值及MPC值的药代动力学参数，并将结果与体外模型进行比较。材料与方法：安徽省细菌耐药监控中心保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC43300以及安徽医科大学实验动物中心提供的雌性新西兰白兔28只，体重2.5-3kg。采用琼脂二倍稀释法测定ATCC43300对VAN的MIC值。肉汤法富集浓度为3×1010CFU/ml的ATCC43300，取菌液100μl用L棒均匀涂抹在每个含有倍比稀释浓度的抗菌药物MH琼脂平皿上，每个药物浓度接种4个平皿，细菌总量为1.2×l010CFU/ml，72h后无菌落生长的最低药物浓度即为该药的初测防耐药突变浓度(provisional mutant prevention concentration, MPCpr)。为了精确测定MIC99及MPC值，将不同浓度抗菌药物平板上恢复生长的细菌数与原菌液浓度的比值取对数，与抗菌药物的浓度作曲线即为细菌恢复生长曲线。从处于MSW不同部位(底部、中部、上部)的含药平板上挑取耐药突变菌株，采用琼脂倍比稀释法(MHA)、脑心浸液琼脂倍比稀释法(BHIA)及Etest法测定耐药突变菌株的MIC值。104CFU的细菌点种于二倍稀释法配制的MHA及BHIA平板上，35℃孵育24h，抑制细菌生长的最低药物浓度为耐药突变菌株的MIC值。Etest法测定耐药突变菌株的MIC值遵使用说明书。对原始菌株及所有耐药突变菌株进行Spa类型的鉴定及分子生物学分析。采用琼脂二倍稀释法测定S. aureus ATCC43300的VAN、LVX、RFP以及FOM的MIC值。采用简化棋盘法测定VAN与LVX、RFP、FOM联用后的MIC值，计算FICI值。肉汤法富集浓度为1010CFU/ml细菌，应用上述琼脂平板倍比稀释法测定VAN单用及其分别与LVX、RFP、FOM联合使用对ATCC43300的MPC值，比较筛选出缩小MSW的最佳联用方案。建立兔组织笼感染模型。感染3天后给予每天两次的不同药物剂量的万古霉素静脉点滴治疗，以期兔组织笼内的药物浓度位于MIC值以下，MIC值和MPC值之间以及MPC值以上。采用高效液相色谱仪测定组织液中的万古霉素药物浓度。采用DAS2.0软件(芜湖，中国)对测定的万古霉素药物浓度数据按照非房室模型进行处理，以第6次用药后达稳态的24小时药代动力学曲线下的面积作为AUC24，得出Cmax和AUC24。根据MIC、MIC99和MPC结果，计算出AUC24/MIC99及AUC24/MPC。每只兔子治疗前，治疗期间每次给药前及治疗结束后的24、48及72小时均从组织笼内抽取组织液300μl，测定其中的细菌浓度。各采集标本用生理盐水进行10倍稀释(1:101~1:107)，分别取100μl的组织液样品接种于不含药物MH琼脂平板上，37℃孵育24小时，进行菌落计数。为了排除其中万古霉素药物对细菌的生长限制作用，每份样品均经过充分稀释，以保证其中的药物浓度处于MIC值以下。检测的细菌浓度的低限为2×102CFU/ml。为了了解治疗过程中的细菌药物敏感性的变化，上述每份标本同时接种于含2MIC及4MIC的万古霉素的MH平板上，37℃孵育48小时，进行菌落计数，检测的细菌浓度低限为10CFU/ml。治疗前，治疗期间每天给药前及治疗结束后24、48及72h对恢复生长的细菌进行MIC测定。根据PK/PD参数将实验中的兔子进行分组，对每组间出现的耐药突变频率进行Fisher精确检验。以实验中生理盐水对照组为参照，P<0.05时认为两组间的差异有统计学意义。结果：从药物浓度12μg/ml的MHA琼脂平板上筛选的耐药突变菌株，经MHA测定MIC值为2μg/ml。而用BHIA检测耐药突变菌株的MIC值时，则能够发现更显著地变化。用Etest法则可以检测出耐药突变菌株微小的MIC值变化。当外界的药物浓度压力解除时，耐药突变菌株的MIC值可以回落至原有的水平。Spa类型的鉴定及分子生物学分析结果表明所有菌株的Spa的基因序列名称均为t421。VAN、 LVX、 RFP、 FOM单药对ATCC43300的MIC分别为1μg/ml、0.25μg/ml、0.008μg/ml和2μg/ml；MPC分别16μg/ml、2μg/ml、>32μg/ml和64μg/ml，MSW(MPC/MIC)为16、8、>4000和32。VAN联合LVX、RFP及FOM均可使各自联用的MIC不同程度的降低，三种联合方案计算得出的FICI分别为1，1，0.75。联合LVX可使VAN的MPC降至原来的1/2倍，联合RFP可使VAN的MPC降至原来的1/4倍，联合FOM可使VAN的MPC降至原来的1/16倍。联合6.4μg/ml (8MIC×80%)的VAN可使FOM的MPC降至2μg/ml，缩小MSW为FOM单药的1/32倍；联合28.8μg/ml (16MIC×90%)的FOM可使VAN的MPC降至1μg/ml，缩小MSW为单药VAN的1/16倍。体内万古霉素的药物浓度落在MSW内，也即体外测定的MIC99及MPC之间，可以筛选出MRSA的耐药突变菌株。在进行动物实验之前，该结论在体外模型中已经得到验证。体内测定的能够限制耐药突变富集的药代动力学参数是AUC24/MPC>15h，其中AUC24是24小时药代动力学曲线下的面积。而体外测定的AUC24/MIC值≥200h也是适用于体内模型的预测限制耐药突变体生长的药代动力学参数。结论：万古霉素对ATCC43300的细菌恢复生长曲线中有一较宽的平台期，这可能是临床治疗中失败的决定性原因。由于药物组织浓度分布的不同，万古霉素的药物浓度可能落在MSW内，导致耐药突变株的富集，伴随而来的就是临床感染MRSA菌株对万古霉素敏感性的下降。所以，由于长时间或超范围使用万古霉素就带来了细菌MIC值的漂移现象。VAN与另三种药物联用，可以明显降低各自单独用药对MRSA的MPC，其中联合FOM降低其MPC的幅度最大，缩小其MSW的效果最好。本实验用兔组织笼感染模型验证了AUC24/MIC值≥200h是预测体内限制耐药突变体生长的药代动力学参数。而保持治疗过程中的血药浓度大于MPC值或使得治疗过程中AUC24/MPC>15h是阻止细菌耐药性产生的最直接的方法。