乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染肝细胞引发一系列的肝脏炎症性疾病,严重影响人类的健康。已有研究证实,HBV感染所致多种淋巴细胞功能失调不仅是乙肝患者持续感染的重要机制之一,而且在乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视、甚至是决定性的作用。但HBV所致的免疫失调的具体机制尚未完全明确。众多研究表明,多种免疫调节分子在HBV感染所致淋巴细胞功能失调中发挥着重要作用。Tim-3(T cell immunoglobulin- and mucin-domain-containingmolecule-3,Tim-3)是在2002年被发现的,特异性表达在分化终末期的Th1细胞上的新型免疫调节分子。Tim-3与其配体之一—galectin-9相互作用可负向调控IFN-γ的产生,并可影响T细胞耐受的形成。近来的研究结果显示,Tim-3除了在Th1细胞上表达外,在细胞毒性T细胞(Te1细胞)、树突状细胞和NK细胞上均有表达,并且通过影响这些细胞的功能,参与多种疾病的发生发展过程。我室在前期研究中发现,Tim-3mRNA在慢乙肝患者外周血单个核细胞上的表达升高,提示Tim-3很可能在HBV慢性感染中发挥着重要的作用。本课题利用临床研究、体外细胞实验和动物实验研究Tim-3在慢乙肝发生发展中的表达及功能,为进一步深入阐明HBV感染相关疾病的发病机制提供实验依据。方法1.Tim-3在慢乙肝患者体内的表达1.1 Tim-3在慢乙肝患者体内不同淋巴细胞亚群中的表达收集慢乙肝患者、健康志愿者和脂肪肝患者新鲜外周肝素抗凝血,流式细胞术检测Tim-3在外周血不同淋巴细胞亚群中的表达。收集慢乙肝患者和脂肪肝患者肝组织,免疫组化检测Tim-3在肝脏中的表达。1.2慢乙肝患者外周血不同淋巴细胞亚群上Tim-3的表达与血清ALT水平,HBVDNA等的相关性分析利用Prism GraphPad软件对慢乙肝患者外周血不同淋巴细胞亚群上Tim-3的表达与患者血清ALT水平,HBV DNA量进行Spearman相关性分析。2.HBV感染对Tim-3表达的影响2.1以人NK92细胞系为研究对象体外模拟研究HBV感染对Tim-3表达的影响取对数生长期的人NK细胞系NK92细胞,利用电穿孔转染法将HBV表达质粒pcDNA3-1.1HBV转入细胞内,以含200μg/mL G418的培养基稳筛1～2周。同时以转染pcDNA3空载体的NK92细胞为对照细胞。利用RT-PCR和流式细胞术检测Tim-3的表达。2.2以HBV转基因小鼠为研究模型研究HBV感染对Tim-3表达的影响利用Percoll分离液密度梯度离心法分离HBV转基因小鼠肝脏内单个核细胞,并以正常Balb/c小鼠作为对照,流式细胞术检测小鼠肝脏内单个核细胞上Tim-3的表达。3.Tim-3对NK细胞和CD8~6T细胞功能影响的研究3.1 Tim-3对NK细胞功能影响的研究3.1.1阻断Tim-3对NK92功能的影响以NK92细胞为效应细胞,给予Tim-3抗体/Tim-3-Fc融合蛋白、同型抗体或PBS缓冲液作用后,按不同效靶比(1:1、5:1和25:1)与人肝癌细胞系HepG2或HepG2.2.15细胞进行共孵育4小时,CCK-8试剂盒检测细胞杀伤效率,ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ分泌。3.1.2阻断Tim-3对慢乙肝患者外周血淋巴细胞杀伤功能的影响分离慢乙肝患者外周血单个核细胞为效应细胞,给予Tim-3抗体、同型抗体或PBS缓冲液后,研究效应细胞对靶细胞HepG2或HepG2.2.15细胞的杀伤效率和IFN-γ分泌。3.2 Tim-3对肝炎模型小鼠肝脏CD8~+T细胞功能影响的研究3.2.1制备小鼠HBV肝炎模型利用尾静脉高压注射法将HBV表达质粒pcDNA3-1.1HBV注入小鼠体内制备小鼠HBV肝炎模型,同时以pcDNA3质粒制备小鼠模型对照。在不同时间点处死小鼠,实时免疫荧光检测(IFMA)试剂盒检测小鼠血清中表面抗原、表面抗体和e抗原的水平,免疫组化检测肝细胞内HBc的表达。实时定量PCR检测血清中HBV DNA的水平。谷丙转氨酶(ALT/GPT)检测试剂盒测定血清谷丙转氨酶活性。3.2.2 Tim-3在模型小鼠肝脏内单个核细胞上的表达分离模型小鼠和对照小鼠肝脏内单个核细胞,流式细胞术检测Tim-3在肝脏内单个核细胞上表达。3.2.3构建特异针对Tim-3的shRNA表达载体设计并合成针对Tim-3或无关序列的shRNA寡核苷酸,退火后与shRNA表达载体pmU6相连,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得阳性重组子,并被分别命名为Tim-3shRNA-1,Tim-3shRNA-2和unshRNA。3.2.4体外验证Tim-3 shRNA表达载体的抑制效果利用脂质体转染法将shRNA表达质粒转染入小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,24、48和72小时后收集细胞,RT-PCR和western blot检测Tim-3和β-actin表达,同时检测Tim家族另一成员—Tim-1的表达以验证Tim-3 shRNA抑制效果的特异性。3.2.5 shRNA抑制Tim-3表达对小鼠肝炎模型肝脏内CD8~+T细胞功能的影响利用尾静脉高压注射法将pcDNA3-1.1HBV与Tim-3shRNA或unshRNA表达载体注入小鼠体内,流式细胞术检测肝脏内单个核细胞上Tim-3的表达水平以验证Tim-3shRNA的体内抑制效果,同时检测细胞内IFN-γ表达研究Tim-3被抑制后对细胞功能的影响。4.统计学分析采用GraphPad Prism4软件对实验数据进行Mann-Whitney非参数U检验、Kruskal-Wallis非参数H检验和Spearman相关性分析。p＜0.05或p＜0.01有统计学意义。结果1.Tim-3在慢乙肝患者外周血单个核细胞和肝脏内单个核细胞上表达升高1.1 Tim-3在慢乙肝患者外周血单个核细胞,尤其是NK细胞和CD8~+T细胞上表达升高流式细胞术检测结果显示,Tim-3在慢乙肝患者外周血单个核细胞上的表达显著高于健康志愿者和脂肪肝患者对照(p＜0.05)。进一步的分析结果显示,Tim-3在NK细胞上高表达,而且慢乙肝患者外周血NK细胞上的Tim-3的表达水平显著高于健康志愿者和脂肪肝患者(p＜0.05)。此外,Tim-3在T细胞,尤其是CD8~+T细胞上的表达显著高于健康志愿者和脂肪肝患者(p＜0.0001)。1.2 Tim-3在慢乙肝患者肝脏内单个核细胞上表达升高为了进一步研究Tim-3在慢乙肝患者肝脏内的表达,我们收集慢乙肝患者和脂肪肝患者肝穿标本,利用免疫组化的方法研究Tim-3在肝脏内的表达。结果显示,慢乙肝患者肝组织中Tim-3的表达显著高于脂肪肝患者,而且从细胞形态上可以看出Tim-3主要在肝脏内浸润淋巴细胞上表达。1.3慢乙肝患者外周血T细胞和CD8~+T细胞上Tim-3表达水平与ALT水平正相关统计学分析发现,T细胞和CD8~+T细胞上Tim-3表达水平与患者血清ALT水平均呈正相关(r=0.41,p＜0.01),而与HBV DNA滴度并不相关,提示Tim-3很可能通过调节CD8~+T细胞的功能参与肝损伤过程。2.HBV感染可上调Tim-3表达2.1 HBV表达质粒转染NK92细胞后可上调Tim-3的表达已有研究结果显示在慢乙肝患者外周血单个核细胞和NK细胞上可检测到HBV的肝外感染。为研究HBV感染是否可以上调细胞中Tim-3表达,本研究利用HBV表达质粒pcDNA3-1.1HBV转染的NK92细胞,作为HBV体外感染的细胞模型(空载体pcDNA3转染组为对照)。半定量RT-PCR的结果显示,在pcDNA3-1.1HBV转染的NK92细胞中检测到HBx和HBc mRNA表达,并且检测到Tim-3的表达上调,显著高于空载体对照;流式细胞术检测结果显示,Tim-3蛋白在HBV表达质粒转染的NK92细胞上的表达显著高于空载体对照,与RT-PCR结果相吻合。2.2 HBV转基因小鼠肝脏内单个核细胞以及NK细胞上Tim-3的表达升高HBV转基因小鼠模型是目前较为公认的HBV感染模型,本研究利用该模型进一步研究HBV感染对Tim-3表达的影响。流式细胞术分析结果显示:在HBV转基因小鼠肝脏内单个核细胞以及NK细胞上Tim-3的表达水平显著高于正常对照小鼠(p＜0.05)。3 Tim-3抑制NK细胞和CD8~+T细胞的功能3.1 Tim-3阻断后可上调NK细胞的杀伤功能3.1.1 Tim-3阻断后可以上调NK92细胞的杀伤功能为了研究Tim-3对NK细胞功能的影响,我们利用Tim-3的中和抗体或Tim-3-Fc融合蛋白阻断Tim-3的信号通路,研究Tim-3对NK92细胞杀伤和细胞因子分泌的影响。1)细胞杀伤率:CCK-8检测结果显示,随着Tim-3中和抗体或Tim-3-Fc融合蛋白作用浓度的增加,其NK92细胞细胞杀伤效率呈现明显的剂量依赖性,当Tim-3中和抗体或Tim-3-Fe融合蛋白作用浓度为5μg/mL时,NK92细胞的杀伤率达到平台期,因此,将该浓度确定为随后实验的作用浓度。在不同效靶比条件下,Tim-3中和抗体或Tim-3-Fc融合蛋白处理组NK92细胞杀伤率显著高于同型抗体对照和PBS缓冲液对照作用的细胞(p＜0.05或p＜0.01),且该作用呈现明显的剂量依赖性。然而Tim-3抗体阻断后并不能上调NK92细胞对K562细胞的杀伤效率。半定量RT-PCR检测结果显示:galectin-9在HepG2和HepG2.2.15细胞上表达水平较高,而在K562细胞上表达水平较低。2) IFN-γ的分泌:将NK92细胞与HepG2.2.15细胞(效靶比25:1)共同培养4小时后,分离细胞培养上清,ELISA检测IFN-γ的分泌。结果显示:与同型抗体对照和PBS缓冲液相比,Tim-3抗体阻断可显著上调NK92细胞在杀伤HepG2.2.15细胞时的IFN-γ分泌(同型对照抗体组421±19 pg/mL,PBS缓冲液对照402±32pg/mL,Tim-3抗体阻断组521±27 pg/mL)(p＜0.05)。3.1.2 Tim-3抗体阻断后可上调慢乙肝患者外周血单个核细胞的杀伤效率慢乙肝患者体内NK细胞上存在Tim-3的表达升高,提示Tim-3有可能通过影响NK细胞的功能参与HBV慢性感染过程。为了验证这种可能性,我们分离慢乙肝患者外周血单个核细胞,按不同效靶比(5:1、10:1和25:1),与HepG2或HepG2.2.15细胞共培养4小时后,CCK-8检测各组细胞杀伤率。结果显示,与同型抗体对照和PBS缓冲液对照相比,Tim-3抗体阻断后可上调慢乙肝患者外周血单个核细胞的杀伤效率(p＜0.05)。3.2 shRNA抑制Tim-3表达可上调HBV小鼠肝炎模型肝脏内CD8~+T细胞功能本研究发现,除NK外,慢乙肝患者外周血CD8~+T细胞的Tim-3表达明显上调,提示Tim-3可能影响CD8~+T细胞功能。由于临床分离慢乙肝患者CD8~+T细胞数量少、杀伤能力差、且靶细胞不易选择,本实验以小鼠肝炎模型研究Tim-3对CD8~+T细胞功能的影响。HBV转基因鼠对HBV完全耐受,不能完全反映慢乙肝患者体内情况。为此,本研究利用尾静脉高压注射法制备HBV小鼠肝炎模型,进一步研究HBV感染对Tim-3表达的影响。3.2.1制备HBV小鼠肝炎模型尾静脉高压注射法制备HBV小鼠肝炎模型是近年来建立并得到广泛认肯的肝炎模型。本实验利用该模型进一步验证HBV感染对Tim-3表达的上调作用。实时定量PCR检测发现模型制备第1天后可检测到小鼠血清HBV DNA,并于第7天达高峰,至第18天检测不到。免疫组化方法证实模型小鼠肝细胞内表达HBc。IFMA试剂盒检测结果显示随着抗原水平的降低,模型制备后第7天可以检测到血清中的表面抗体。模型小鼠和对照小鼠血清谷丙转氨酶水平于第1到3天升高,随后降低至正常水平,两者之间没有显著性差异。3.2.2 Tim-3在HBV肝炎模型小鼠肝脏内CD8~+T细胞上表达升高模型制备后在不同时间点处死小鼠,分离小鼠肝脏内单个核细胞,利用流式细胞术检测Tim-3表达。结果显示模型制备后第1天和第3天,模型小鼠和对照小鼠肝脏内T细胞上Tim-3的表达显著升高,但两组之间没有差异。但在第7天至第18天,模型小鼠肝脏内T细胞上Tim-3表达显著高于对照小鼠(p＜0.05或p＜0.01)。进一步分析发现主要是肝脏内CD8~+T细胞上Tim-3表达显著升高(第10天,p＜0.01)。在脾脏中并未检测到Tim-3表达升高。3.2.3 HBV模型小鼠肝脏内CD8~+T细胞上Tim-3表达升高伴随血清中和抗体滴度升高进一步的分析发现:在模型制备后第10天,HBV模型小鼠体内可以检测到较高水平的针对表面抗原的中和抗体,但小鼠之间抗体滴度水平的差异较大。将HBV模型小鼠以表面抗体水平50 mIU/mL(接近模型小鼠抗体水平的均值-58mIU/mL)为界分为两组:高抗体组(＞50 mIU/mL)和低抗体组(＜50 mIU/mL)。分析结果显示高抗体组模型小鼠肝脏内CD8~+T细胞上Tim-3的表达显著高于低抗体组(p＜0.05)。3.2.4 Tim-3shRNA表达载体可有效抑制RAW264.7细胞上Tim-3的表达为了进一步研究Tim-3对CD8~+T细胞功能的影响,我们成功构建Tim-3shRNA表达载体Tim-3shRNA-1和Tim-3shRNA-2,以及针对无关序列的unshRNA表达载体,并转染RAW264.7细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测结果显示,Tim-3shRNA-1转染组细胞与其他组细胞相比,Tim-3 mRNA水平和蛋白质水平的表达均显著降低(p＜0.05),并且这种抑制效果是特异的,并不影响Tim家族另一成员Tim-1的表达。3.2.5 shRNA抑制Tim-3表达可上调HBV小鼠肝炎模型肝脏内CD8~+T细胞功能上述针对Tim-3的shRNA表达载体与HBV表达质粒同时以尾静脉高压注射法注入小鼠,体内研究Tim-3对模型小鼠CD8~+T细胞功能的影响。流式细胞术结果显示:于模型制备后第10天Tim-3shRNA-1处理组CD8~+T细胞上Tim-3的表达水平降低,显著低于无关对照unshRNA处理组Tim-3表达未受影响(p＜0.05),且Tim-3shRNA-1处理组CD8~+T细胞上IFN-γ表达水平显著高于后者(p＜0.05)。3.2.6 shRNA抑制Tim-3表达可下调血清中和抗体的水平进一步对小鼠血清中和抗体的检测发现:pcDNA3-1.1HBV+Tim-3shRNA-1组小鼠血清中和抗体水平显著低于pcDNA3-1.1HBV+unshRNA组(p＜0.05)。结论1.慢乙肝患者外周血单个核细胞,尤其是NK细胞和CD8~+T细胞,及肝脏内单个核细胞上Tim-3表达显著高于对照者。2.HBV感染可上调NK92细胞和HBV转基因小鼠以及尾静脉高压法制备的肝炎模型小鼠肝脏内NK细胞或CD8~+T细胞上Tim-3的表达。3.Tim-3途径阻断可上调NK92细胞和慢乙肝患者外周血单个核细胞的细胞杀伤效率和IFN-γ分泌。4.shRNA表达载体抑制Tim-3表达,可上调模型小鼠肝脏内CD8~+T细胞IFN-γ表达,同时模型小鼠中和抗体水平降低。创新点及意义1.本研究发现慢乙肝患者外周血单个核细胞(尤其NK细胞和CD8~+T细胞)和肝脏内单个核细胞上Tim-3表达显著升高,并分别利用转染了HBV表达质粒的NK92细胞和HBV转基因小鼠为模型,首次证实HBV感染可上调Tim-3的表达,为Tim-3参与HBV慢性感染过程提出新的论点。2.本研究利用NK92细胞系和慢乙肝患者外周血单个核细胞,证实阻断Tim-3途径可上调NK细胞的杀伤效率,提示Tim-3有可能作为慢乙肝治疗的新靶点。3.本研究利用特异针对Tim-3的shRNA表达载体抑制小鼠肝炎模型肝内Tim-3表达,发现抑制Tim-3表达可上调CD8~+T细胞IFN-γ的表达,且降低模型小鼠血清中和抗体水平,提出Tim-3可抑制CD8~+T细胞的功能,并间接影响中和抗体产生的观点。