酸枣仁在我国传统中医药中被广泛用于治疗失眠和焦虑症,整体动物实验证明其具有镇静安神功效,酸枣仁皂甙A(JuA)是其主要提取物。有研究报道证明JuA是一种对钙调蛋白(CaM)的非竞争性抑制剂,对小鼠自发活动有抑制作用。近期研究报道证明高剂量JuA可以抑制海马CA1区由于青霉素钠介导的过度活动,JuA对在体和体外大鼠海马内谷氨酸介导的兴奋信号通路具有抑制作用。以上证明JuA对中枢神经系统(CNS)具有抑制作用,尤其是在海马。海马作为边缘系统的重要组成部分,神经元高度集中,具有相对简单而高度序化的层状结构,神经元相对独立分布,在睡眠、学习、记忆、情绪反应及植物神经功能方面有重要作用。我们实验室在以往的研究工作中,用JuA作用于整体动物,检测小鼠自发活动,证明其具有镇静催眠作用。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统内重要的抑制性神经递质,其传递作用由GABA受体介导,存在于神经元膜上的GABA受体,在脑区内介导突触前抑制和突触后抑制效应。该受体与人的许多神经性疾病密切相关,包括癫痫、酒精中毒、失眠和帕金森综合征等。GABAA受体和苯二氮卓类药物镇静催眠作用密切相关,并且与镇静催眠作用密切相关的部分受体在出生后发育期海马神经细胞上高表达。我们前期的工作初步提供了JuA发挥镇静催眠作用的证据,但是目前尚未有关于酸枣仁皂甙A(JuA)对海马神经细胞作用以及对其上GABA受体基因表达影响的研究报道,JuA对海马神经细胞作用的机制是什么,是否和传统经典的苯二氮卓类药物相似,通过作用于GABA受体发挥镇静催眠作用,其抑制作用的分子机理等还不清楚。本研究采用现代生物医学技术对JuA镇静催眠分子机制进行了初步探讨。我们首先进行了体外新生大鼠海马神经细胞培养,对文献报道的原代神经元培养方案进行了优化,并且用细胞骨架蛋白微管相关蛋白(MAP2)作为标志物,运用免疫细胞化学和免疫荧光方法,对培养的神经元进行了鉴定。结果显示培养物为MAP2阳性细胞,表明培养物为高纯度的海马神经细胞,可以进一步用于JuA对其作用的研究。其次,我们以JuA作用于培养的新生大鼠海马神经细胞作为研究对象,观察其对海马神经细胞的影响。首先,在相差显微镜下,我们观察到了相当数量具有典型外形特征的海马神经细胞,然后运用MTT方法检测JuA对海马神经细胞生长存活率的影响,不同浓度JuA(0.05g/L和0.01g/L)与海马神经细胞共同孵育7d,与空白对照组比较可见两个浓度JuA作用于海马神经细胞后,其MTT值均明显上升。实验结果显示,JuA组的海马神经细胞存活率明显高于对照组(p﹤0.05),0.05g/L和0.1g/L浓度的JuA对海马神经细胞的生长均有促进作用,能明显提高海马神经细胞的存活率,且呈现一定的剂量相关性,提示本试验中所选取的两个浓度JuA对体外培养新生大鼠海马神经细胞的生长有一定的促进和保护作用。最后,我们对JuA镇静催眠作用可能的分子机理进行了初步探讨。我们以体外培养新生大鼠海马神经细胞作为研究对象,运用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测JuA对培养海马神经细胞GABA受体基因表达量的影响,并且和地西泮(DZ)作用结果相比较。实验结果表明0.1 g/L JuA和10μM DZ作用于海马神经细胞24h后,均能上调部分GABA受体基因α1、α5和R1及下调β2的表达量;而高剂量0.1 g/L JuA作用72小时后能下调α1和β2的表达量,对α5和R1的表达量无明显影响,此结果不同于地西泮作用72h后所介导的α1、α5、β2和R1表达量的降低;低剂量JuA作用24h及72h后都能上调部分GABA受体基因α1、α5、β2和R1的表达量。JuA和地西泮作用于海马神经细胞不同时间均能引起部分GABA受体基因(α1、α5、β2和R1)表达量变化,提示0.1 g/L JuA短时间作用可能能够介导镇静催眠作用和肌肉松弛作用,而长时间作用则有可能同地西泮相似能导致耐受性和成瘾性;然而,低剂量0.05 g/L JuA无论短时间或长时间作用均可能诱导镇静催眠和肌松作用,并且没有明显的诱导耐受性和成瘾性的倾向。所以,0.1 g/L和0.05 g/L剂量的JuA均可能介导镇静催眠作用,但是0.05 g/L剂量JuA由于其没有明显的导致耐受性和依赖性的分子生物学机制,可能更适用于临床治疗失眠症。