【摘 要】
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猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）的病原体为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,可以引起仔猪的肠道传染病。主要是对新生仔猪致死率极高,甚至达到100%,会引起新生仔猪水样腹泻、脱水及呕吐等症状。不过一般不会引起成年猪死亡。自从1973年PED在我国多有发生,2013年在美国爆发,2010年在我国出现了
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猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）的病原体为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,可以引起仔猪的肠道传染病。主要是对新生仔猪致死率极高,甚至达到100%,会引起新生仔猪水样腹泻、脱水及呕吐等症状。不过一般不会引起成年猪死亡。自从1973年PED在我国多有发生,2013年在美国爆发,2010年在我国出现了大规模的暴发,从而对我国养猪业造成局限性和区域性的影响,对我国生猪产业产生严重打击。为了防控PEDV的发生主要手段还是为猪群接种疫苗,然而,目前市面上已经被广泛应用的商品化的灭活疫苗和弱毒活疫苗不能够对新生仔猪提供完全保护,传统灭活疫苗多选用经典毒株,这造成疫苗对各地的免疫保护能力参差不齐;而弱毒活疫苗虽然免疫效果远远好于传统灭活疫苗,但其研发成本及时间大大增加,也存在着一定的散毒的风险,并且基于目前的研究和临床观察发现,有弱毒活疫苗与流行毒株进行基因重组的现象发生。所以,研制一种安全并且有效的新型PEDV疫苗来防控PEDV的爆发就显得尤为重要。本研究是以乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBcAg）作为呈现PEDV S1的抗原表位的载体,构建含PEDV S1的病毒样颗粒（VLPs）。其中纤突蛋白S是PEDV重要的结构蛋白之一,可以高效诱导机体产生特异性中和抗体。据此,本试验通过设计融合PCR将乙肝核心抗原的1-74aa与PEDV S1包含B细胞表位的270bp连接起来,经过双酶切及测序验证,成功构建PET-32a（+）-HBcAg（1-74aa）-PEDV S1重组质粒。然后与HBcAg（83-144aa）进行连接,即将PEDV S1 B细胞表位插入到HBcAg的免疫优势区（MIR）,经过双酶切验证成功构建了 PET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1重组质粒。将重组质粒转化到BL21里,IPTG诱导蛋白表达,表达后纯化复性蛋白,并通过透射电镜检测到成功形成病毒样颗粒,表明利用大肠杆菌表达系统成功构建了 PEDV S1病毒样颗粒。为后续PEDV疫苗的研制提供了进一步的参考。构建具有免疫原性的HBcAg-PEDV S1候选疫苗,通过小鼠免疫试验对VLPs疫苗的免疫原性进行初步评价。用小鼠流行性腹泻病毒抗体（PEDVAb）ELISA检测试剂盒来检测小鼠血清特异性抗体水平结果显示,HBcAg-PEDV S1 VLPs在一免后第二周可以刺激机体产生PEDV特异性抗体,在二免后抗体水平在第一周增长趋势变大,第二周趋于平缓上升,三免后PEDV抗体水平上升到最高值,但抗体效价与疫苗组相比较低,在三免的第二周两者之间差异不大;小鼠淋巴细胞增殖试验与细胞因子IL-4、IFN-γ检测结果从数据分析来看,免疫HBcAg-PEDV S1 VLPs可以提高机体IL-4的表达水平;同时免疫之后IFN-γ水平持续上升。综上所述,HBcAg-PEDV S1 VLPs具有良好的免疫原性,为以后的PEDV候选疫苗的进一步研制奠定了基础,也为PEDV本体动物试验提供了数据参考。
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