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西洋参又称花旗参、美国人参,是世界公认珍贵的药食两用植物,在抗衰老、调节机体免疫力及强心护肝等方面有着重要的作用。影响西洋参药理活性作用的最重要因素是其含有的人参皂苷含量和种类。人参皂苷的生物合成途径以2,3-氧化角鲨烯为中心可以分为上游MVA途径和MEP途径,以及下游环化、羟基化和糖基化步骤。糖基化反应是人参皂苷合成途径中的最后一步,也是决定单体皂苷活性的重要一步。因此,对人参皂苷合成途径中糖基转移酶的相关研究是当下的研究热点。近年来,国内外学者对人参中的糖基转移酶基因做了许多研究,但西洋参中的糖基转移酶基因研究工作还没有具体报道。人参皂苷的生物合成是许多编码基因参与互作的结果,通过对这些编码基因的启动子进行研究,可以探究他们对外界刺激的响应调控模式。启动子是位于编码基因5’端上游的调控区域,负责RNA聚合酶的识别与结合。启动子区域上的顺式作用元件在受到生物或非生物环境因子刺激的情况下,会与转录因子等反式作用因子相互作用,从而对下游的编码基因进行转录水平上的调节。因此,对编码基因上游启动子的表达研究有助于深入了解这些编码基因的调控机理。本文以西洋参愈伤组织为出发材料,完成了两个UDP-葡萄糖基转移酶功能基因(Pq3-O-UGT1和Pq3-O-UGT2)编码区的克隆、序列分析、重组载体构建、异源表达鉴定、启动子克隆和遗传转化等内容。基于以上研究内容,得到了如下的主要研究结果:1.两个UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆。利用SMARTer RACE技术从西洋参中扩增获得了两个UDP-糖基转移酶的编码区cDNA序列全长,将两个糖基转移酶的编码区cDNA序列全长进行测序后分别命名为Pq3-O-UGT1和Pq3-O-UGT2。对它们的氨基酸序列进行了序列分析和同源建模,将两个糖基转移酶的编码区cDNA序列提交至Genbank并获得最终检索号KR028477和KR106207。2.两个UDP-葡萄糖基转移酶基因的功能分析。分别扩增两个UDP-糖基转移酶的编码区cDNA序列,利用酶切连接技术构建了酵母异源表达工程菌Y-pAUR123-3GT1和Y-pAUR123-3GT2。利用SDS-PAGE蛋白电泳分析蛋白表达产物和HPLC-MS技术分析酶促反应产物,确定Pq3-O-UGT1编码的氨基酸序列能催化原人参二醇生成人参皂苷Rh2,以及Pq3-O-UGT2编码的氨基酸序列能催化人参皂苷Rh2和F2生成人参皂苷Rg3和Rd。3.两个UDP-葡萄糖基转移酶基因编码区内含子分析。利用西洋参基因组DNA为模板扩增得到了UDP-糖基转移酶基因Pq3-O-UGT1和Pq3-O-UGT2的gDNA序列全长。发现在Pq3-O-UGT1的编码区gDNA序列的608nt-771nt位置中存在一个大小为163bp的内含子结构,在Pq3-O-UGT2的编码区gDNA序列的152nt-164nt位置中存在一个大小为12bp的内含子结构。4.两个UDP-葡萄糖基转移酶基因上游5’端启动子序列的克隆。采用TAIL-PCR方法从西洋参基因组DNA中克隆得到了Pq3-O-UGT1基因组DNA序列5’端上游非编码区2611 bp长度的启动子序列和Pq3-O-UGT2基因组DNA序列5’端上游非编码区1344bp长度的启动子序列。对两个启动子的序列分析结果显示在这两个启动子序列中除了CAAT和TATA核心元件外还存在着大量响应环境因子的顺式调控元件。5.两个UDP-葡萄糖基转移酶基因不同长度5’端缺失启动子表达载体在烟草中的活性分析。利用酶切连接技术分别构建了6个启动子缺失片段的重组农杆菌工程菌,并转化烟草进行启动子活性分析。结果发现6个启动子片段都能够在农杆菌和烟草中驱动GUS基因表达,具有启动子活性。启动子活性分析结果表明Pq3-O-UGT1启动子的4个缺失片段中P-528活性最高,为12.6 nmol MU/min/μg protein,相当于CaMV35S启动子活性的25%。Pq3-O-UGT2启动子的2个缺失片段中P-1420活性最高,为27.3 nmol MU/min/μg protein,相当于CaMV35S启动子活性的64%。同时将Pq3-O-UGT1启动子4个缺失片段的进行烟草遗传转化,对T2代烟草幼苗进行干旱、低温和光照非生物胁迫以及NAA、SA、GA激素处理,结果发现发现低温和GA刺激能显著提高Pq3-O-UGT1启动子全长P-2629的活性,而SA能明显提高缺失片段P-1950的活性。