口腔鳞状细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,具有侵袭性强及易淋巴转移等特性。口腔白斑属于口腔潜在恶性疾病,有可能逐渐发展成为口腔鳞状细胞癌。目前口腔白斑恶变及口腔鳞状细胞癌发生发展的过程及机制尚不清楚。巨噬细胞具有多种效能,包括吞噬、抗原呈递、分泌细胞因子等,在固有免疫和适应性免疫中都占据重要地位。在肿瘤微环境中,巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞,是肿瘤微环境中重要的成员之一,具有显著的多样性和可塑性。根据不同的刺激,巨噬细胞表型会发生改变,表现不同的表型和功能。巨噬细胞表达的信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)和口腔鳞状细胞癌细胞表达的CD47蛋白之间的作用,触发了“别吃我”和“自我识别”信号。SIRPα-CD47信号通路在许多肿瘤的发生发展及免疫逃逸中发挥了重要作用。目前,SIRPα-CD47信号通路在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌发病过程中的作用及机制还不明确。本课题主要探讨SIRPα-CD47信号通路在口腔白斑癌变及口腔鳞状细胞癌发展中的作用;研究口腔鳞状细胞癌细胞与巨噬细胞相互作用中SIRPα-CD47信号通路的相关机制;探讨壳聚糖-叶酸包裹siRNA-CD47制备的纳米粒对口腔鳞状细胞癌细胞的抑制效果。本研究内容分为以下四部分:第一部分 SIRPα 蛋白在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌中的表达目的:SIRPα 是巨噬细胞表面表达的蛋白,巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥了重要作用。到目前为止,巨噬细胞上的SIRPα在口腔白斑和口腔鳞状细胞癌中的表达尚不清楚。本研究旨在探讨巨噬细胞上的SIRPα在口腔白斑和口腔鳞状细胞癌中的表达。方法:应用免疫组织化学方法检测口腔白斑和口腔鳞状细胞癌中SIRPα的表达,并用巨噬细胞标记物CD68、CD163和免疫荧光双染的方法分别标记巨噬细胞及M2型巨噬细胞,分析 SIRPα 与巨噬细胞之间的关系。结果:结果显示SIRPα在口腔白斑中的表达比口腔鳞状细胞癌组织明显增高,并且SIRPα的表达水平与巨噬细胞CD68表达水平呈正相关关系,而与CD163的表达水平呈负相关关系。结论:SIRPα的表达可能在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌的发展过程中起到重要作用。第二部分 SIRPα在巨噬细胞与口腔鳞状细胞癌细胞相互影响中的调控作用研究目的:肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,肿瘤细胞可调控巨噬细胞表型从促炎M1型转换为促肿瘤M2型。本研究旨在探讨在巨噬细胞与口腔鳞状细胞癌细胞相互影响中,SIRPα对巨噬细胞的调控作用。方法:检测口腔鳞状细胞癌细胞系Cal-27细胞及SCC9细胞的培养上清对巨噬细胞表达SIRPα的影响。PMA诱导THP-1细胞成为巨噬细胞后,利用Transwell小室共培养Cal-27细胞与巨噬细胞,检测口腔鳞状细胞癌细胞对巨噬细胞表达SIRPα的影响。利用siRNA敲低巨噬细胞表达的SIRPα后,检测与Cal-27细胞共培养后巨噬细胞的表型转变。应用PDTC抑制巨噬细胞的转录因子NF-κB,检测SIRPα与巨噬细胞表型转变的关系。使用逆转录-实时定量分析PCR检测巨噬细胞表达的细胞因子的改变,中性红试剂检测巨噬细胞的吞噬能力,Transwell分析巨噬细胞和Cal-27细胞的迁移、侵袭能力的改变。结果:体外研究发现巨噬细胞与Cal-27共培养9天后,SIRPα的表达逐渐减少。在共培养体系中,Cal-27细胞诱导巨噬细胞转换为M2型,表达CD163、IL-10、TGF-β 的水平升高。敲低巨噬细胞表达的SIRPα,发现巨噬细胞表达CD163、IL-10、TGF-β的水平升高,而IL-6和TNF-α水平降低。与此同时,巨噬细胞的吞噬能力降低,而增殖和迁移能力增强。另一方面,与敲低巨噬细胞SIRPα后共培养的Cal-27细胞的迁移能力增强,而侵袭能力减弱。PDTC抑制巨噬细胞的转录因子NF-κB后,巨噬细胞表达的SIRPα增多,并且IL-6、TNF-α mRNA水平升高,提示巨噬细胞转换为M1型。巨噬细胞的吞噬能力增强,迁移、侵袭能力减弱。结论:SIRPα 可能通过调控巨噬细胞的表型参与口腔鳞状细胞癌的发生发展过程。第三部分 CD47在口腔鳞状细胞癌中的作用机制研究目的:CD47是一种抗吞噬信号分子,能够结合巨噬细胞表面的SIRPα,从而使肿瘤细胞逃避吞噬。在许多肿瘤中CD47分子高表达并且被认为是很好的治疗靶标,然而在口腔鳞状细胞癌的发生发展过程中CD47的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨CD47在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中的作用机制。方法:利用siRNA敲低Cal-27细胞表达的CD47,检测口腔鳞状细胞癌细胞的增殖是否发生改变。转染shRNA-CD47慢病毒到Cal-27细胞内敲低CD47的表达(shRNA-knockdown CD47,Sh-KDCD47),利用流式细胞术检测 Cal-27 的细胞凋亡。通过Transwell小室研究敲低CD47的表达对Cal-27细胞的迁移侵袭能力的影响。Sh-KDCD47的Cal-27细胞注射入裸鼠皮下,观察1个月,检测敲低CD47表达对于肿瘤形成大小的影响。将巨噬细胞和Cal-27细胞进行共培养,检测CD47对于巨噬细胞吞噬能力的影响。利用Western blot技术检测Cal-27细胞CD47与STAT3/JAK2信号通路的关系。结果:siRNA敲低CD47的表达能够抑制Cal-27细胞的增殖能力。Sh-KD CD47对Cal-27细胞的凋亡并没有明显的影响。Sh-KD CD47明显抑制Cal-27细胞的迁移、侵袭以及抗吞噬能力。裸鼠成瘤实验验证敲低CD47的表达能够抑制肿瘤细胞Cal-27在动物体内生长。Cal-27细胞敲低CD47表达后,STAT3以及JAK2的蛋白表达相应减少,提示CD47与STAT3/JAK2信号通路有关。结论:CD47可能参与了 口腔鳞状细胞癌的发生发展过程,是一种潜在的治疗靶标。第四部分壳聚糖-叶酸-siRNA CD47分子的纳米载体的制备、鉴定和肿瘤抑制研究目的:小分子干扰RNA是RNAi基因抑制功能的效应分子,具有核酸和小分子化合物的双重特性,易被核酸酶降解,具有稳定性差、半衰期短、细胞内转染效率低和靶向性差等缺点。本研究旨在利用壳聚糖-叶酸(CS-FA)做为siRNA-CD47分子的纳米载体,研究其在口腔鳞状细胞癌细胞中生长抑制的作用,为其应用研究奠定理论基础。方法:采用复凝聚法合成CS-siRNA及CS-FA-siRNA纳米粒。检测红外波谱表征以及核磁共振H谱,采用紫外分光光度法测定CS-FA中FA的含量。应用动态光散射法测定纳米粒的粒径、粒径分布以及表面电势,透射电镜研究纳米粒的形态特征,CCK-8 检测 siRNA-CD47、CS-siRNA-CD47 和 CS-FA-siRNA-CD47对Cal-27细胞增殖的影响,激光扫描共聚焦显微镜观察Cal-27细胞对纳米粒的摄取效果。结果:制备得到CS-FA纳米粒,并合成CS-siRNA-CD47和CS-FA-siRNA-CD47纳米粒,siRNA-CD47为Cy5标记的显红色荧光的干扰RNA。CS-FA-siRNA-CD47纳米粒对Cal-27细胞增殖的抑制效果明显比CS-siRNA-CD47纳米粒以及脂质体lipofect2000转染更强。激光共聚焦显微镜下观察到Cal-27细胞对CS-FA-siRNA-CD47纳米粒的摄取比对照组快。结论:CS-FA-siRNA-CD47纳米粒通过利用CS-FA的运载能力、叶酸对肿瘤细胞的靶向能力以及siRNA-CD47的肿瘤抑制作用实现靶向治疗。