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心肌梗死是造成人类死亡的四大主要疾病之一,该疾病会导致心肌细胞数量缺失,进一步导致病人死亡。由于成年化的心肌细胞不能分裂,具有不可再生性,因此,应用心肌细胞移植治疗心肌梗死已经成为一个新的的研究热点。近年来,随着对人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)的深入研究,使得应用胚胎干细胞来源的心肌细胞治疗心肌梗死成为可能。胚胎干细胞具有全能性,在体内外特定的条件下,能定向分化为三个胚层来源的各种类型的细胞,包括心肌细胞。胚胎干细胞分化的心肌细胞和胎儿形成早期的心肌细胞在电生理、钙运作、肌原纤维结构和心肌收缩蛋白的表达等各个方面都有很大的相似性。然而,胚胎干细胞分化的心肌细胞存在异质性,利用这种异质的心肌细胞进行移植,会导致心律不齐,因此,获得纯度较高的心肌细胞是进行心肌细胞移植的前提条件。α肌球蛋白重链(alpha-myosin heavy chain, aMHC)在胚胎干细胞分化为心肌细胞初期特异性表达,并且其表达量随分化时间的增加呈现上调趋势,而指导其特异性表达的是aMHC基因启动子。因此,aMHC基因的启动子能够作为调控序列对胚胎干细胞分化的心肌细胞进行标记,使其易于被识别和分离纯化,从而进行心肌细胞的移植治疗。本研究的目的在于构建含有心肌特异性启动子aMHC的灭瘟素(Blasticidin,简称Blar)抗性基因以及绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的慢病毒表达载体aMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-neo,应用慢病毒转染技术将慢病毒转染至人胚胎干细胞,通过筛选稳定转染的人胚胎干细胞并诱导其分化为心肌细胞,进一步分离纯化胚胎干细胞源的心肌细胞。本研究内容及结果如下：1、重组慢病毒表达载体的构建、鉴定以及扩增应用PCR技术克隆出灭瘟素(Blar)抗性基因和口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)的具有自剪切功能的多肽2A序列,2A序列能够使同一启动子启动的多基因平衡表达。将Blar-2A片段插入慢病毒载体aMHC-EGFP-Rex-neo,构建含有aMHC启动子的灭瘟素抗性基因以及绿色荧光蛋白基因的多顺反子慢病毒表达载体aMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-neo,通过酶切及测序鉴定后,对慢病毒载体进行扩增。将重组慢病毒载体与psPAX2^ pMD2.G载体共同转染293T包装细胞,运用磷酸钙转染技术包装出完整的重组慢病毒。2、慢病毒转染人胚胎干细胞及稳定细胞株的获得将获得的慢病毒感染低代数的人胚胎干细胞,由于转染后的人胚胎干细胞带有人胚胎干细胞特异性的启动子Rex,能启动新霉素(Neomycin, neo)抗性蛋白的表达。因此,用药物G418筛选,能获得转染成功的人胚胎干细胞。光学显微镜下机械挑取单克隆细胞,并进行扩大培养,应用PCR技术检测是否获得稳定转染的人胚胎干细胞,将稳定转染的人胚胎干细胞命名为neo-hESCs。进一步,对neo-hESCs进行核型分析,经过鉴定,转染的人胚胎干细胞具有正常的二倍体核型,说明慢病毒转染并不改变人胚胎干细胞的核型,为进一步从细胞水平探讨特异性启动子介导的心肌细胞筛选纯化奠定了基础。3、体外诱导分化心肌细胞、药物筛选及鉴定将neo-hESCs经视黄酸信号通路直接诱导分化为心室肌细胞和心房肌细胞。诱导分化第10天,心肌细胞开始跳动。提取分化第9天、10天、12天的心肌细胞RNA,反转录为cDNA,检测aMHC的表达情况。结果表明,分化第9天,心肌细胞即表达aMHC.于荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,发现有EGFP的表达,并且表达区域呈现跳动的状态,表明分化的心肌细胞表达EGFP。诱导分化第10天,用药物灭瘟素筛选心肌细胞,每隔24小时更换含灭瘟素的心肌细胞培养基。加药筛选的第3天,跳动的心肌细胞开始聚团,非心肌细胞部分已经死亡。筛选第4天,对照组中的细胞全部死亡,而实验组中存活的心肌细胞聚团跳动,将筛选后的心肌细胞命名为Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes。于荧光显微镜下观察Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes,观察到有EGFP表达。对Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes进行心肌特异性肌钙蛋白T(Cardiac troponin T, cTnT)的免疫荧光染色,于荧光显微镜下观察有cTnT的表达,表明neo-hESCs分化的心肌细胞具有正常心肌细胞的典型特征。应用FACS技术筛选Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes,鉴定其纯度。筛选结果表明,心室肌细胞的纯度达到95%,心房肌细胞的纯度达到93%。进一步,对心室肌细胞和心房肌细胞这两种心肌细胞亚型做分子特征分析。IRX4 (Iroquois homeobox protein 4)是心室肌细胞特异性表达基因,能促进心室肌细胞的发育。因此,本实验提取了筛选后的心室肌和心房肌细胞的RNA,通过Real time-PCR检测两者IRX4的表达情况。结果分析表明,心室肌细胞IRX4的表达量是心房肌细胞的10多倍,说明诱导分化并且经过筛选后得到的是心室肌细胞和心房肌细胞两种心肌细胞亚型。本实验通过构建心肌特异性启动子α-MHC调控的重组慢病毒表达载体,转染至人胚胎干细胞,建立稳定转染的细胞系,并将转染的胚胎干细胞分化为心室肌细胞和心房肌细胞,筛选出纯化的心室和心房肌细胞,为深入研究心肌发生发育的关键调控机制以及临床应用奠定良好的基础。