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研究背景与目的:胶质母细胞瘤是是胶质细胞产生的肿瘤集合,它是最常见和最致命的原发性脑肿瘤[1],也是最具攻击性的胶质瘤类型。由于其复杂的表型,它也被称为多形性胶质母细胞瘤（GBM）。多形性胶质母细胞瘤是恶性程度最高的胶质瘤（世界卫生组织WHO IV级）,尽管使用目前的标准治疗,进行了积极的手术、放射治疗和化疗干预,患者的中位生存期也仅为诊断后15个月[2]。近年来,白藜芦醇,一种存在于虎杖、桑椹和葡萄等植物中的多酚类化合物,它具有诸如预防肿瘤和心脑血管疾病、抗炎和抗氧化等有益的生物学功效。业已发现,白藜芦醇能有效抑制多种肿瘤细胞的体外生长,诱导其分化和凋亡,其中包括胶质母细胞瘤细胞系。但是不同的胶质母细胞瘤细胞系由于某些未知原因对其具有药物敏感性差异。外泌体是一类由活细胞主动分泌到体外的,直径在30nm-200nm的盘状微囊泡,其中包含了多种复杂的RNA以及蛋白质等。它可介导细胞间的交流和迁移,与肿瘤细胞的生长也有密切的联系。研究发现,肿瘤细胞会分泌大量携带恶性转化相关蛋白的外泌体,推测其与肿瘤细胞的药物敏感性密切相关。鉴于以上相关资料的搜集与整理,本课题研究,认为外泌体可能是造成胶质母细胞瘤白藜芦醇敏感性差异的可能原因。为此,本实验目的为:1.验证U251、LN428胶质瘤细胞对白藜芦醇的药物敏感性差异。2.探究肿瘤外泌体与U251、LN428共培养后,对白藜芦醇药物敏感性的改变。3.检测白藜芦醇处理前后U251、LN428胶质瘤细胞外泌体各蛋白的表达差异,探究导致胶质瘤细胞白藜芦醇敏感性的差异的关键调控蛋白。4.通过蛋白调控因子的生物信息学分析探究其药物敏感调控功能。材料与方法:本课题选用一对白藜芦醇敏感和耐药的人胶质母细胞瘤细胞系U251和LN428细胞作为研究对象,采用MTT法核实白藜芦醇对两者的敏感性差异;通过HE染色观察药物处理后细胞凋亡的形态学变化。同时,采用超速离心法提取白藜芦醇用药前后U251及LN428细胞上清液中外泌体,通过电镜及Western-blotting对其加以鉴定。应用纳米颗粒跟踪分析技术对各组外泌体进行定量分析,测定细胞的外泌体分泌水平。为探究外泌体对细胞药物敏感性的影响,将LN428细胞与U251/N或U251/Res外泌体共孵育48h后再用浓度为100μmol/L的白藜芦醇处理48h;反之亦然,将U251细胞与LN428/N或LN428/Res外泌体共孵育48h后再用浓度为100μmol/L的白藜芦醇处理48h,最后将各组进行MTT检测其细胞活性。为了进一步探讨不同人胶质母细胞瘤对白藜芦醇的敏感性差异,先运用BCA法对外泌体总蛋白进行定量,然后通过液相色谱-串联质谱法对外泌体各蛋白进行定性与定量,分析比对加药前后各指标的变化,发现导致药物敏感或耐受的因子,通过GO富集分析和KEGG生物信息学分析对其功能及分子机制进行预测,并总结其相互关联及影响。结果:1.U251细胞系在白藜芦醇处理48h后,细胞出现皱缩、脱落,其生长明显受阻,细胞数量显著减少（85.7%）。LN428细胞系在白藜芦醇处理后,与对照组相比,细胞形态未发生明显变化,细胞数量未显著减少。MTT显示,白藜芦醇处理48h的U251细胞的OD值（OD=0.310+0.020,细胞活性为50.1%）,低于对照组（OD=0.618+0.103,p<0.01）;而LN428白藜芦醇处理48h后（OD=0.743+0.047）,细胞活性与对照组（OD=0.722+0.185,p=0.375）则无明显差异。2.对外泌体进行的透射电镜检测显示,提取液中含有大量30nm-200nm的椭圆形或圆形盘状囊泡结构。对外泌体进行WB检测发现,两个细胞系分泌的外泌体中均存在特异性表达蛋白CD63,而β肌动蛋白则未被检测到,说明本实验成功富集样品中的外泌体且无明显其余细胞蛋白的污染。3.对用药前后胶质瘤细胞U251及LN428分泌外泌体进行的纳米颗粒跟踪分析发现,所提取的外泌体直径在30nm-200nm之间,呈散在分布或聚集成团。NTA外泌体定量分析提示,白藜芦醇可使U251细胞的外泌体分泌增加4.2倍,而LN428细胞的外泌体分泌仅增加12.1%。4.外泌体与细胞共培养的MTT结果显示,U251/N外泌体能提高LN428对白藜芦醇的药物敏感性（OD=0.624+0.027）,而U251/Res外泌体（OD=0.703+0.047,p=0.043）与PBS对照组（OD=0.743+0.040,p=0.011）则不能。对于U251细胞,LN428/N外泌体（OD=0.295+0.020,p=0.145）和LN428/Res外泌体（OD=0.334+0.036,p=0.173）均不能改变U251对白藜芦醇的敏感性。5.运用Label-free液相色谱-串联质谱法发现,U251细胞外泌体有123种不同的蛋白质,而LN428细胞外泌体则达216种。U251/N外泌体具有更高的角蛋白（KRT包括KRT18,KRT19）,H2A组蛋白家族成员X水平（H2AX包括H2AFX,HIST1H2AD）,较低的Ras相关蛋白1（Rap1包括Rap1B,Rap1A）,聚合物丝形成肌动蛋白水平（F-actin包括ACTB,ACTA2）和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白包括GNAS,GNAI）。相反,LN428/N外泌体的蛋白质组模式与U251/N外泌体的蛋白质组模式不同,它表达较低的KRT,H2AX和较高的Rap1和F-肌动蛋白。白藜芦醇可以通过改变KRT,H2AX,Rap1,F-肌动蛋白和G蛋白等蛋白的表达,进而改变U251和LN428细胞的蛋白质组学模式。6.基于GO功能聚类分析的蛋白质生物信息学分析发现,在生物过程中,U251/N外泌体在染色质沉默和表皮发育中具有更高的表达,而U251/Res外泌体含有更多参与氧转运、G蛋白偶联受体信号通路和细胞蛋白代谢过程的蛋白质。分子功能分析表明,U251/N外泌体更多地作用在蛋白质异二聚化活性和DNA结合。U251/Res外泌体蛋白在G蛋白复合物结合、脒基核苷酸结合和GTP酶活性上比U251/N外泌体有更高的表达。LN428/N外泌体与LN428/Res外泌体有多个共同参与关键生物过程和分子功能的蛋白质。经筛选,前5个生物过程分别是核小体组装,基于微管的过程,染色质沉默,细胞骨架组织和氧运输。此外,分子功能活性中丰富度最高的是细胞骨架的结构成分和酶活性（包括结构分子活性,蛋白质异二聚化活性,GTP酶活性和氧转运活性）。7.借助KEGG信号通路富集分析结果显示,U251/N外泌体可能通过调节Rap1信号通路与坏死性凋亡通路来增强耐药的LN428细胞对白藜芦醇的药物敏感性。结论:1.白藜芦醇敏感的胶质瘤细胞U251在药物处理后外泌活性更高。2.来自白藜芦醇敏感U251胶质瘤细胞的外泌体含有更多H2AX和更低的Rab1,F-肌动蛋白和G蛋白,它能提高LN428对白藜芦醇的药物敏感性。3.白藜芦醇可以增加处理胶质瘤细胞的外泌体耐药蛋白水平,而不论其药物敏感性如何。