论文部分内容阅读
家禽养殖中常有细菌性疾病的发生,而抗菌药物杀灭细菌时会促使革兰氏阴性菌的脂多糖(lipololysaccaaiide,1LPS)的释放。脂多糖和抗菌药物均可诱发肝损伤,LPS与抗菌药物在致禽类肝损伤机制及药物修复机理亟待研究。本文在LPS和阿莫西林克拉维酸钾联合致鸡原代肝细胞损伤模型的基础上,进一步探究其损伤机理以及复方甘草酸单胺的修复效应。主要研究内容和结果如下:1 LPS和阿莫西林克拉维酸钾联合致鸡原代肝细胞损伤模型的建立采用改良的二步胶原酶灌流法,分离lkg左右的海蓝公鸡肝细胞,细胞培养板培养24h,观察细胞贴壁和生长状况。在生长良好分化的细胞中加入0,30+60,30+80,30+100,30+120,30+140μg/mLLPS和阿莫西林克拉维酸钾(n=3)。培养24h后,光学显微镜观察细胞形态,MTT法测定细胞存活率。选取适合的肝细胞损伤剂量,继LPS/AC加入细胞培养液24h之后,各力加入1,10,100μg/mL的复方甘草酸单胺,MTT法测定细胞存活率并取细胞培养上清液,检测其中的ALT、AST的含量。结果显示:大部分细胞会在6h之内贴壁,在24h内细胞形态开始变化,细胞分化。当LPS/AC浓度为30+60μg/mL和30+80μg/mL时,细胞典型形态没有发生变化,细胞活性为 81.52 ± 2.35%和 75.54 士 2.79%;当 LPS/AC 浓度为 30+lOOμg/mL 时,细胞膜和细胞形态明显不规则,细胞活性为53.56 ± 6.17%(P<0.01);当LPS/AC浓度为30+140μg/mL时,活细胞数量显著减少。而添加不同浓度的复方甘草酸单胺的肝细胞细胞活性明显升高,ALT和AST相应下降(P<0.01)。因此,我们选取30+100μg/mL的LPS和阿莫西林克拉维酸钾的浓度作为肝细胞致损伤模型的剂量,而复方甘草酸单胺有一定的保护作用。2 LPS和阿莫西林克拉维酸钾联合致鸡原代肝细胞氧化应激的影响空白对照组加入普通培养基,损伤组加入30+100μg/mL的LPS/AC,保护组先加入1,10,100μg/mL的复方甘草酸单胺处理24h,再加入30+l00Lng/mL的LPS/AC处理24h。收集细胞,检测各组细胞中的SOD,MDA,GSH,GSH-PX和ROS的含量。结果显示:与对照组相比,30+100μg/mL的LPS和AC可以使肝细胞SOD,GSH,GSH-PX含量极显著下降(P<0.01),但添加CAG之后,这些指标均有所上升。而MDA和ROS极显著升高(P<0.01),GAG也可以使其含量下降。表明LPS/AC可以通过氧化应激的方式使肝细胞发生损伤。3 LPS和阿莫西林克拉维酸钾联合对鸡肝细胞凋亡方面的影响3.1 LPS和阿莫西林克拉维酸对肝细胞凋亡率影响及复方甘草酸单胺的修复效应空白对照组加入普通培养基,损伤组加入30+10Oμg/mL的LPS/AC,保护组先加入1,10,100μg/mL的复方甘草酸单胺处理24h,再加入30+100μg/mL的LPS/AC处理24h。用不含EDTA的胰酶消化细胞,离心并收集细胞,PBS洗涤,先后用Annexin V-FITC和PI染色,用流式细胞仪检测。结果可以看出,培养液中加入LPS/AC 24h后,细胞凋亡率上升10%左右(P<0.01);而用CAG提前处理24的肝细胞凋亡率极显著下降(P<0.01)。因此,LPS/AC可能是通过促进鸡原代肝细胞凋亡的方式来使鸡肝脏损伤的。3.2 Caspase-3活性的测定Caspase-3是凋亡途径中的关键蛋白,起到凋亡执行者的作用,因此,caspase-3的活性一定程度上可以代表细胞凋亡的情况。细胞按照上述方法处理,收集细胞,用PBS洗涤,依据试剂盒上的说明提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。结果表明,模型组的caspase-3活性极显著升高(P<0.01)。同样地,用GAG处理能够使其活性降低。3.3透射电子显微镜观察肝细胞线粒体超微结构的变化同样按照上述分组处理细胞,收集细胞,PBS洗涤细胞,用戊二醛固定,制作电镜切片,透射电镜观察拍照。相根据显微镜照片显示,空白对照组显示正常细胞的超微结构,包括平滑的圆形细胞核,连续的核膜,完整的紧实的棒状线粒体。而用LPS/AC处理的鸡原代肝细胞线粒体发生肿胀,线粒体变成圆形,中间充有液泡,内部的嵴减少。因此,LPS/AC会损伤肝细胞线粒体,揭示我们应从线粒体方面研究其如何对细胞造成损伤。3.4测定肝细胞中凋亡相关mRNA和蛋白表达量试验分组如上述所示,提取细胞的 mRNA,通过荧光定量 PCR 测定 caspase-3,caspase-9,bax,bcl-2,cyt-c和fas的mRNA表达量。提取细胞总蛋白,通过Western blot技术测定caspase-3,caspase-9,bcl-2,bax和cyt-c蛋白的表达量。结果显示,损伤组肝细胞caspase-3,caspase-9,bax,fas和cyt-c的mRNA表达量均显著上升,而加入不同浓度的CAG之后,表达量有所降低。而损伤组bcl-2的mRNA表达量显著下降,同样地,CAG可以增加其在肝细胞的表达量。Caspase-3,caspase-9,bax,cyt-c和bcl-2的蛋白表达变化和mRNA结果基本一致。表明LPS/AC主要可能是通过线粒体途径来介导鸡肝细胞凋亡的。