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背景和目的肿瘤的生长、侵袭和转移是一个多因素参与、多基因改变和多步骤演进的复杂过程,它与肿瘤细胞本身和宿主基质细胞之间的相互作用、肿瘤血管生成和宿主免疫系统的反应等有关,在众多的因素中肿瘤诱导的血管生成倍受重视,目前认为它与肿瘤生物学行为的关系甚为密切。大量的研究证实,肿瘤在新生血管形成前,只能达到大约1-2mm3的大小,而且少有远处转移灶形成。然而在新生血管形成后,肿瘤会成倍的增长,转移的几率也会随之增加。由此可知肿瘤血管生成不仅对原发瘤本身的生长至关重要,同时也是肿瘤呈侵袭性生长和发生远处转移的必备条件。肿瘤的血管生成是一个涉及基底膜降解、内皮细胞迁移、增殖的复杂过程。所有这些步骤均受多种生长因子及其受体、细胞因子调控,其中血管活性调节因子（血管生成促进因子和抑制因子）发挥着中心调控作用。当血管生成促进因子和抑制因子两者间的平衡被打破时,即会启动肿瘤血管生成的过程。在各种血管活性因子中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前已知的作用最强的促血管生成因子,它能特异性地直接或间接作用于血管内皮细胞,进而促进血管新生。有研究发现,它在多种肿瘤的生长、转移中都起到重要作用。而目前调控VEGF表达的确切机制还不甚清楚,主要认为它可能与低氧调节、细胞因子调节、癌基因调节等有关。肿瘤细胞从原发瘤的增殖生长到远处转移灶的形成要经过漫长的过程和许多的生物学改变阶段,这个进展的过程在人体往往需要几年甚至几十年的时间,所以该过程的观察在人体身上不可能实现,要完整观察这个过程必须建立相应的动物转移模型,但大部分实验动物由于其在荷瘤状态下自身寿命的限制我们很难动态的、连续的观察到这个过程。在以往的实验研究过程中我们发现将Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）细胞接种于C57BL/6近交系小鼠后,随着肿瘤传代次数的增加其肺转移发生的几率也逐渐升高,在此基础上我们通过Lewis肺癌荷瘤小鼠体内连续传代的方法模拟肿瘤在体内生长演变的过程,以期建立能够模拟肿瘤生长、侵袭和转移动态全过程的动物模型,寻找一种观察肿瘤生物学特征动态变化的新方法。在该动物模型建立的基础上本实验拟观察Lewis肺癌生长、侵袭和转移动态过程中肿瘤组织内血管内皮生长因子（VEGF）、缺氧诱导因子1a（hypoxia-inducible factor 1a,HIF-1a）和微血管密度（microvesseldensity,MVD）表达的变化,以揭示血管生成与肿瘤生长转移的关系及其可能机制。方法将LLC细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。初次接种时将LLC细胞吹打成单细胞悬液,以1×106/0.2ml接种于C57BL/6小鼠右腋部背侧皮下,建立第1代荷瘤鼠模型。以后每次将传代2周的荷瘤鼠断颈处死,无菌条件下剥除肿瘤组织,制成瘤细胞悬液,以1×106/0.2ml接种于C57BL/6小鼠右腋部背侧皮下,在小鼠体内连续传代。分别于第2代、第8代和第15代接种C57BL/6小鼠15只作为早期组、中期组和晚期组。实验过程中观察各组小鼠的出瘤时间,自接种后第6日起隔日一次测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。于接种后第28天以颈椎脱臼法处死小鼠,瘤体剥离后固定并观察其肺转移灶情况。采用免疫组织化学法（SP法）检测各组肿瘤组织内MVD、VEGF和HIF-1a的表达情况,并进行常规组织学观察。应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行方差分析、x2检验、非参数检验,相关分析采用二元变量的等级相关分析（Kendall’stau-b）,以a=0.05作为检验标准。结果1.早、中、晚期各组小鼠的出瘤时间分别为（4.60±1.18）天、（3.73±1.03）天和（2.93±0.96）天,随着传代次数的增加早、中、晚期各组小鼠的出瘤时间缩短,差异有显著性（P＜0.01）。2.由早、中、晚期各组小鼠肿瘤生长曲线可以看出随着传代次数的增加,肿瘤的生长速度渐渐加快,差异有显著性（P＜0.05）。3.肿瘤大体观:随着传代次数的增加早、中、晚期各组荷瘤鼠肿瘤组织由苍白、质韧到红润、质脆,由局限生长到浸润皮肤导致皮肤破溃,浸润胸壁肌层甚至突破胸腔,瘤组织剖开后由坏死无出血到有明显出血。4.肺转移灶:早、中、晚期各组小鼠的肺转移率分别为13.3%（2/15）、60.0%（9/15）和100%（15/15）,呈逐渐增高的趋势,差异有显著性（P＜0.01）。早期组仅有两只镜下可见由几十个异形肿瘤细胞构成的微转移灶;中期组肉眼可见肺转移灶,数目多在1-5个之间,直径多在2mm以下,镜下可见肿瘤组织呈巢团状散在分布;晚期组肺转移灶数目从4-30个不等,直径多在1-2mm之间,有些出现直径大于2mm的转移灶,镜下亦见呈巢团状,但多发,面积较大。5.早、中、晚期各组小鼠瘤组织中MVD计数分别为（24.73±10.38）、（41.27±13.50）和（55.80±21.31）,随着传代次数的增加,肺转移率的升高,早、中、晚期各组小鼠瘤组织中MVD计数也逐渐增多（P＜0.01）。6.早、中、晚期各组小鼠瘤组织中VEGF的表达逐渐增多,转移肿瘤中VEGF的表达明显高于无肺转移者,差异有显著性（P＜0.05）,且VEGF与MVD呈正相关（r=0.530,P＜0.01）。7.早、中、晚期各组小鼠瘤组织中HIF-1a的表达逐渐增多（P＜0.05）,且VEGF与HIF-1a的表达成正相关（r=0.751,P＜0.01）。结论1.Lewis肺癌在C57BL/6小鼠体内连续传代过程中出瘤速度提前,生长速度加快,侵袭能力增强,同时肺转移发生的几率越来越高,转移灶数目从少到多,直径从小到大,基本上呈现了肿瘤生长、侵袭转移的动态全过程,为探讨血管生成在肿瘤生长、转移过程中作用的研究打下了基础。2.肿瘤细胞分泌的VEGF促进了血管生成,且其表达与肿瘤的恶性程度和转移潜能密切相关。3.血管生成在Lewis肺癌生长、转移的动态过程中发挥了重要作用。其可能机制为肿瘤的缺氧引起了HIF-1a的过表达,启动了VEGF的转录,在其它血管活性因子的参与下,促使了血管新生,从而使肿瘤细胞得以持续生长和扩散转移。