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目的：明确14例糖原累积病Ⅲ型（GSD Ⅲ型）患者糖原脱支酶（AGL）基因突变情况，并结合患者临床资料探讨AGL基因型和临床表型相关性。建立干血滤纸片和白细胞测定酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）活性的方法及正常人参考值，应用于糖原累积病Ⅱ型（GSDⅡ型）患者酶学诊断。对酶学诊断为GSDⅡ型的2例患儿进行GAA基因突变检测，并进一步探讨GAA基因型和临床表型的相关性。
方法：（1）采用PCR、DNA直接测序法对临床表现为肝大、低血糖、运动耐力下降的14例GSDⅢ型患者AGL基因进行突变检测，检出突变的片段均经DNA双向测序证实。采用限制性内切酶片段长度多态性分析证实3个新剪切突变，采用荧光PCR结合基因扫描方法证实4个缺失突变的缺失碱基数。（2）利用GAA特异性水解荧光底物4-MUG的原理，采用阿卡波糖抑制其同功酶，建立干血滤纸片和白细胞测定GAA活性的方法。取700例正常DBS样本和50例正常白细胞样本做对照建立DBS和白细胞GAA活性正常参考值，并对5例临床疑诊为GSDⅡ型患者进行GAA酶学诊断。（3）采用PCR、DNA直接测序法对酶学诊断为GSD Ⅱ型的2例患儿进行GAA基因突变检测，检出突变经双向测序证实。
结果：（1）14例GSDⅢ型患者中共检出20种突变类型，包括5种剪切突变：IVS6+1G>A、IVS6-1G>A、IVS14+1G>T、IVS26-2A>C、IVS32-12A>G；7种无义突变：Q40X、R469X、R864X、S910X、S929X、R977X、Y1428X；7种缺失突变：c.408-411delTTTG、c.753-756delCAGA、c.2455-2456delAA、c.2717-2721delAGATC、c.2823delT、c.3802-3803delAG、c.4399-4403delAGATT；1种插入突变：c.4234insT。5种为已报道突变（IVS14+1G>T、IVS32-12A>G、R864X、S910X、R977X），其余15种为新突变。14例患者中仅2例检出1个突变，突变检出率为93％。其中，IVS14+1G>T突变频率最高，占18％。共发现6个新AGL基因SNP位点。AGL基因突变异质性高，其基因型和临床表型相关性尚待明确。（2）干血滤纸片测定法具有良好的精密度，室温或低于室温保存4周对GAA活性无明显影响。正常新生儿和儿童-成人干血滤纸片GAA活性参考值范围分别为13.31～ 47.37，9.23～26.39pmol/punch/h；正常人白细胞GAA活性参考值范围：15.79～52.90 nomL/mg protein/h，5例临床疑诊患者均明确诊断为GSDⅡ型。（3）酶学诊断为GSDⅡ型的2例患儿GAA基因检测得到进一步确诊：婴儿型GSDⅡ型携带E579K和 W746X突变，迟发型GSDⅡ型携带M408L和W738X突变，其基因型和临床表型有相关性。
结论：（1）14例中国人GSDⅢ型患者中共发现20种突变类型，15种为新突变，IVS14+1G>T突变是较常见突变类型。AGL基因突变呈高度异质性，其基因型和临床表型的相关性尚待明确。（2）干血滤纸片测定GAA活性敏感、高通量、样本便于运输和保存，适于GSDⅡ型新生儿和高危人群筛查和诊断；白细胞测定GAA活性准确、快速、特异性高，适于GSDⅡ型的确诊和分型。（3）外周血GAA活性测定和GAA基因突变检测均可作为确诊GSDⅡ型的依据。