乳腺癌是全世界女性最常被诊断的癌症和主要的癌症死亡原因。乳腺癌的治疗一般包括手术、化疗等,但都会存在副作用。因此,寻找有效且无毒副作用的抗癌药物,成为了世界医学界重要的研究课题之一。目前,中药在肿瘤治疗研究方面取得了令人瞩目的成就。其中小檗碱,作为一个从中药中提取得到的重要生物碱,经研究在预防及治疗癌症方面展现出极大的潜在价值。中等强度的运动可以有效提高机体免疫能力和抵抗力,降低机体感染疾病机率和患病风险。但目前鲜有将传统的药物治疗与运动联合起来的研究,因此,本研究建立了荷乳腺癌细胞株4T1的BALB/c小鼠移植瘤模型,初步研究运动联合小檗碱的抗乳腺癌活性及其作用机制。(1)运动联合小檗碱对荷瘤小鼠乳腺肿瘤的影响。荷瘤小鼠经过跑步机运动和小檗碱灌胃,观察肿瘤生长趋势及解剖后瘤重等,确认其在体内对乳腺肿瘤的抑制效果。实验结果表明,与模型组相比,小檗碱组和运动联合小檗碱组的肿瘤生长受到明显抑制。运动协同小檗碱组的肿瘤体积为1650.99±83.05 mm~3,显著低于模型组(p<0.01);而单独运动组和单独的小檗碱处理组的肿瘤体积也相对减少。肿瘤的显著减少表明,单独的运动或小檗碱有显著的抑制乳腺癌生长的能力,而当运动与小檗碱结合时,对乳腺癌的协同抑制作用比单独两种效应更强。此外,实验周期结束后,各实验组粪便、乳腺肿瘤组织等在无菌环境下收集起来被用于后续研究。(2)运动协同小檗碱对体外乳腺癌细胞的研究。MTT实验结果显示:小檗碱可引起4T1细胞以剂量和时间依赖性生长抑制。细胞克隆形成的实验也证实小檗碱对细胞增殖形成具有剂量依赖性抑制作用。此外,Hoechst染色法和Annexin-V/PI染色和流式细胞仪检测均发现小檗碱抑制了4T1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。运动因素对肿瘤细胞的作用由MTT测定,结果表明,小鼠运动后血清对乳腺癌细胞的生长起抑制作用。通过流式细胞术发现小鼠运动后血清确实能引起细胞的凋亡,BBR和运动组结合的凋亡率明显高于对照组。综上所述,小鼠运动后血清中存在某种因子可抑制细胞增殖,促进凋亡。(3)运动与小檗碱协同作用对免疫系统的影响。为了探究运动如何影响小鼠免疫系统从而抑制乳腺癌肿瘤生长,通过组织学对小鼠肿瘤分析,与TC组相比,小檗碱联合训练组引起出血、炎性细胞浸润。运动联合小檗碱治疗组的血清中肾上腺素、白介素-6的水平明显升高(p<0.01)。免疫组化分析还显示,运动增加了脾脏和肿瘤的NK1.1+的浸润。为了验证上述结果,q-PCR分析验证了炎性细胞因子和免疫细胞标志物表达的显著变化。与模型组相比,各治疗组CD68等免疫细胞标志物水平显著上调。而CD8被下调。此外,促炎细胞因子IL-1β、IL-6等运动后被上调。(4)利用微生物组学方法检测肿瘤发生(TC组)与运动联合小檗碱处理后(BBRH+EH组)乳腺癌荷瘤鼠肠道微生物菌群的变化。比较对照组的相对丰度发现拟杆菌门的丰度在经过锻炼和药物联合治疗后增加了1.6倍。在属水平上,与未经处理的小鼠的肠道微生物组相比,药物联合治疗组中的小鼠显示出阿利斯特氏菌等属明显减少。在科水平上,经过药物和运动治疗后,Lachnospiraceae等科的丰度均显著下降。结果表明运动联合小檗碱的治疗能够部分恢复由于乳腺肿瘤发生发展而引起的肠道微生物丰度和多样性的减少,保持肠道微生物结构稳定。(5)运动联合小檗碱对肠道代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)的影响。通过气相色谱-质联用仪(GC-MS)检测了肠道中SCFAs产生情况。发现粪便中所有SCFAs的浓度较模型组显著升高。BBRH、BBRH+EH组乙酸均达到显著水平(p<0.05)。与BBRH组相比,BBRH+EH组丁酸和丙酸浓度明显升高,达到显著水平。这些结果表明,运动联合小檗碱的抑瘤作用可能与小鼠肠道微生物产生的SCFAs紧密相关。(6)运动协同小檗碱抗乳腺癌内在机制研究。通过蛋白质印迹法发现运动协同小檗碱能够通过线粒体途径和Fas介导的死亡受体途径引起下游凋亡相关蛋白表达的变化。其联合作用显著增加了肿瘤组织中Fas,FADD和Bid、Cyto c、Bax、casp-3等蛋白的表达,XIAP蛋白和Bcl-2表达水平显着降低。免疫组织化学分析也显示,与TC相比,联合治疗降低bcl-2表达并增加caspase 3表达。这些结果表明Fas介导的凋亡和线粒体途径可能是运动协同BBR以延迟乳腺肿瘤生长的机制。