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研究背景：
流感（Influenza），是一种流感病毒引起的传染性强、传播速度快的急性呼吸道感染疾病。由于A型流感病毒通过重组和变异发生抗原转换和抗原漂移，常常导致流感的大流行，如1918年H1N1流感大流行造成全球5000万人死亡，2009年H1N1流感大流行造成了近30万人死亡。近年来发生的高致病性H5N1、H5N6、H7N9禽流感患者重症发生率和死亡率高，严重危害人类的健康。而且，根据世卫组织最新报道估计，每年多达65万人死于由季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。针对季节性流感的防控和重症患者治疗已经成为一个重要的公共健康问题。被动抗体疗法可以明显降低流感重症患者的死亡率，抗流感病毒中和抗体研发受到了广泛重视。针对流感病毒血凝素头部中和抗体是疫苗免疫和感染后产生的主要保护抗体，具有高效价、血凝抑制活性等重要特点，但是因为流感病毒变异快等原因，HA头部中和抗体不具备茎部抗体的广谱性，可能因为中和表位的氨基酸突变而失效，这也是流感病毒免疫逃逸的重要原因。近几年来，针对血凝素HA的茎部的广谱中和抗体是多数学者认为最有潜力的流感治疗抗体。遗憾的是，遗憾的是，截至2018年，CR8020、MHAA4549A、MEDI8852三个茎部中和抗体在完成II期临床试验后宣布终止[2]，这些临床试验也暴露了HA茎部中和抗体效价普遍偏低，有效剂量大等缺点。针对病情复杂的流感重症患者的治疗，需要大剂量的保护效价更高的中和抗体，实现抗流感病毒中和抗体的临床应用仍有很长的路要走。HA茎部中和抗体与HA头部中和抗体具有不同的中和机制，可能在体内具有不同的保护作用。因此，有必要根据抗流感病毒中和抗体在临床救治中的作用机制，利用双特异性抗体技术等策略研发相对广谱的中和抗体，为下一步研发更符合临床需求的抗流感广谱中和抗体提供依据。
研究目的：
A/CAL/（H1N1）pdm09和H3N2是目前流行的主要A型流感病毒，本研究拟利用双特异抗体技术，构建同时针对对季节性流感A/CAL/（H1N1）pdm09和H3N2具有血凝抑制活性（HI）的双特异中和抗体，在体外通过比较双特异性抗体与原抗体的中和活性，以及在流感病毒感染小鼠模型中研究双特异性抗体治疗后小鼠生存率、病毒载量等指标的变化，为抗流感中和抗体的研发及其临床应用提供依据。
研究方法：
1.将本实验室研发的针对对季节性流感A/CAL/（H1N1）pdm09具有血凝抑制活性（HI）的中和抗体B5与H3N2有广谱血凝抑制活性（HI）的中和抗体2C1，利用CrossMab技术，构建具HI中和活性的双特异抗体B5/2C1-BsAb。
2.利用293f细胞进行大量表达B5/2C1-BsAb，利用本课题组的荧光素酶流感病毒微量中和法鉴定B5/2C1-BsAb中和抗体的效价，同时利用ProteinA纯化制备B5/2C1-BsAb。
3.在H1N1/CAL-luci感染小鼠模型中，通过检测血清luci表达量、观察小鼠体重、生存率等研究双特异抗体B5/2C1-BsAb的预防及保护效果。
4.在H3N2-luci感染小鼠模型中，通过检测血清luci表达量、观察小鼠体重、生存率等研究双特异抗体B5/2C1-BsAb的预防及保护效果。
研究结果：
1.通过CrossMab技术，本研究成功制备了同时针对H1N1/pdm09及H3N2高效价的双特异抗体B5/2C1-BsAb。与亲本抗体相比，双特异抗体B5/2C1-BsAb对H1N1/CAL09、H3N2/VICTORIA2011的同时具有血凝抑制和中和活性，其效价与亲本抗体相近。
2.在293f细胞悬浮培养实现B5/2C1-BsAb的表达达到30mg/L，经proteinA亲和层析柱纯化，可满足动物实验的需求。
3.在H1N1/CAL-luci感染致死小鼠模型中，感染前24小时或者感染后24h小鼠腹腔注射40mg/kgB5/2C1-BsAb与B5体重变化和生存率一致。感染前24小时给药可以提供明显的保护作用，感染后24小时给药二者均没有明显保护作用。
4.在H3N2/VICTORIA-luci感染小鼠模型中，感染前24小时或者感染后24h小鼠腹腔注射40mg/kgB5/2C1-BsAb与2C1体重变化和生存率一致。感染前24小时给药可以提供明显的保护作用，感染后24小时给药二者均没有保护作用。
5.在H1N1/CAL-luci、H3N2/VICTORIA-luci感染致死小鼠模型中，B5/2C1-BsAb、2C1、B5治疗后显著降低小鼠血清中荧光素酶的活性，表明这些抗体在体内可以有效抑制病毒的复制。
研究结论：
本研究成功制备了针对H1N1/CAL、H3N2/VIC具有HI中和活性的双特异抗体；但是，由于缺乏有效的季节性流感病毒感染小鼠模型，本研究在H1N1/CAL-luci和H3N2/VICTORIA-luci感染小鼠模型中，病毒感染前给药，双特异抗体显著提高流感感染小鼠的生存率，感染后给予抗体治疗没有明显的保护作用，但是可以明显抑制病毒复制。结果表明，双特异性抗体B5/2C1-BsAb与亲本抗体2C1、B5具有相似的活性，可以提供相同的保护作用，为研发新型抗流感病毒中和抗体提供了实验和理论依据。
流感（Influenza），是一种流感病毒引起的传染性强、传播速度快的急性呼吸道感染疾病。由于A型流感病毒通过重组和变异发生抗原转换和抗原漂移，常常导致流感的大流行，如1918年H1N1流感大流行造成全球5000万人死亡，2009年H1N1流感大流行造成了近30万人死亡。近年来发生的高致病性H5N1、H5N6、H7N9禽流感患者重症发生率和死亡率高，严重危害人类的健康。而且，根据世卫组织最新报道估计，每年多达65万人死于由季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。针对季节性流感的防控和重症患者治疗已经成为一个重要的公共健康问题。被动抗体疗法可以明显降低流感重症患者的死亡率，抗流感病毒中和抗体研发受到了广泛重视。针对流感病毒血凝素头部中和抗体是疫苗免疫和感染后产生的主要保护抗体，具有高效价、血凝抑制活性等重要特点，但是因为流感病毒变异快等原因，HA头部中和抗体不具备茎部抗体的广谱性，可能因为中和表位的氨基酸突变而失效，这也是流感病毒免疫逃逸的重要原因。近几年来，针对血凝素HA的茎部的广谱中和抗体是多数学者认为最有潜力的流感治疗抗体。遗憾的是，遗憾的是，截至2018年，CR8020、MHAA4549A、MEDI8852三个茎部中和抗体在完成II期临床试验后宣布终止[2]，这些临床试验也暴露了HA茎部中和抗体效价普遍偏低，有效剂量大等缺点。针对病情复杂的流感重症患者的治疗，需要大剂量的保护效价更高的中和抗体，实现抗流感病毒中和抗体的临床应用仍有很长的路要走。HA茎部中和抗体与HA头部中和抗体具有不同的中和机制，可能在体内具有不同的保护作用。因此，有必要根据抗流感病毒中和抗体在临床救治中的作用机制，利用双特异性抗体技术等策略研发相对广谱的中和抗体，为下一步研发更符合临床需求的抗流感广谱中和抗体提供依据。
研究目的：
A/CAL/（H1N1）pdm09和H3N2是目前流行的主要A型流感病毒，本研究拟利用双特异抗体技术，构建同时针对对季节性流感A/CAL/（H1N1）pdm09和H3N2具有血凝抑制活性（HI）的双特异中和抗体，在体外通过比较双特异性抗体与原抗体的中和活性，以及在流感病毒感染小鼠模型中研究双特异性抗体治疗后小鼠生存率、病毒载量等指标的变化，为抗流感中和抗体的研发及其临床应用提供依据。
研究方法：
1.将本实验室研发的针对对季节性流感A/CAL/（H1N1）pdm09具有血凝抑制活性（HI）的中和抗体B5与H3N2有广谱血凝抑制活性（HI）的中和抗体2C1，利用CrossMab技术，构建具HI中和活性的双特异抗体B5/2C1-BsAb。
2.利用293f细胞进行大量表达B5/2C1-BsAb，利用本课题组的荧光素酶流感病毒微量中和法鉴定B5/2C1-BsAb中和抗体的效价，同时利用ProteinA纯化制备B5/2C1-BsAb。
3.在H1N1/CAL-luci感染小鼠模型中，通过检测血清luci表达量、观察小鼠体重、生存率等研究双特异抗体B5/2C1-BsAb的预防及保护效果。
4.在H3N2-luci感染小鼠模型中，通过检测血清luci表达量、观察小鼠体重、生存率等研究双特异抗体B5/2C1-BsAb的预防及保护效果。
研究结果：
1.通过CrossMab技术，本研究成功制备了同时针对H1N1/pdm09及H3N2高效价的双特异抗体B5/2C1-BsAb。与亲本抗体相比，双特异抗体B5/2C1-BsAb对H1N1/CAL09、H3N2/VICTORIA2011的同时具有血凝抑制和中和活性，其效价与亲本抗体相近。
2.在293f细胞悬浮培养实现B5/2C1-BsAb的表达达到30mg/L，经proteinA亲和层析柱纯化，可满足动物实验的需求。
3.在H1N1/CAL-luci感染致死小鼠模型中，感染前24小时或者感染后24h小鼠腹腔注射40mg/kgB5/2C1-BsAb与B5体重变化和生存率一致。感染前24小时给药可以提供明显的保护作用，感染后24小时给药二者均没有明显保护作用。
4.在H3N2/VICTORIA-luci感染小鼠模型中，感染前24小时或者感染后24h小鼠腹腔注射40mg/kgB5/2C1-BsAb与2C1体重变化和生存率一致。感染前24小时给药可以提供明显的保护作用，感染后24小时给药二者均没有保护作用。
5.在H1N1/CAL-luci、H3N2/VICTORIA-luci感染致死小鼠模型中，B5/2C1-BsAb、2C1、B5治疗后显著降低小鼠血清中荧光素酶的活性，表明这些抗体在体内可以有效抑制病毒的复制。
研究结论：
本研究成功制备了针对H1N1/CAL、H3N2/VIC具有HI中和活性的双特异抗体；但是，由于缺乏有效的季节性流感病毒感染小鼠模型，本研究在H1N1/CAL-luci和H3N2/VICTORIA-luci感染小鼠模型中，病毒感染前给药，双特异抗体显著提高流感感染小鼠的生存率，感染后给予抗体治疗没有明显的保护作用，但是可以明显抑制病毒复制。结果表明，双特异性抗体B5/2C1-BsAb与亲本抗体2C1、B5具有相似的活性，可以提供相同的保护作用，为研发新型抗流感病毒中和抗体提供了实验和理论依据。