耐旱耐盐抗除草剂转基因棉花新材料的鉴定

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棉花属于重要的经济作物,但是受土壤干旱和盐碱化面积日益加大的影响,棉花的产量和品质明显下降,给生产和经济带来巨大损失。随着生物技术的不断发展,运用基因工程方法创制耐旱耐盐碱棉花新材料、新种质,是目前棉花领域应用最广泛,最有效的育种途径。ERF(Ethylene responsive factor)类转录因子是植物特有的类蛋白质分子,普遍参与调控植物对外界各种胁迫的应答反应。为了提高棉花对干旱和盐碱的耐受能力,本研究利用农杆菌介导法,将分别从抗旱沙生植物胡杨(Populus euphratica Oliv.)和海水潮汐带红树林植物秋(Kandelia candel (Linn.) Druce)中分离的PeDREB2a和KcERF转录因子基因构建在含CP4抗性标记基因的表达载体上并转化棉花,对转基因棉花进行鉴定与分析,获得了一定数量的转基因棉花株系,为棉花抗逆性的研究提供了一定的实验材料。主要结果如下:(1)通过转化拟南芥,从已构建好的5个表达载体中筛选出表达性状最佳、以rd29A为启动子的双价载体:pCAMBIAl302-KcERF-PeDREB2a,利用农杆菌介导法将其导入陆地常规棉R15,经培养基培育、嫁接、定植、温室培养、PCR分子检测,最终获得32株转基因棉花。(2)转基因棉花通过冬季海南加代、夏季河北继代,最终获得T3代转基因棉花株系。(3)对常规棉花R15进行不同浓度的Kanamycin(Kan)喷施处理,初步确定基其Kan抗性筛选浓度为1500 mg/L,待T3代转基因棉花长至4~5片真叶时,进行Kan喷施,初筛抗性棉株,剔除非抗性棉株。(4)对T3代初筛抗性棉株进行PCR、反转录PCR分子检测,获得6株转基因棉花,通过Southern杂交分析得出,外源基因多以单拷贝的方式插入受体细胞基因组中,转基因植株的遗传遵循孟德尔遗传定律,而且,子代无基因沉默现象。(5)对大田T3代转基因棉花、以及对照组常规棉R15进行草甘膦喷施处理,转基因棉花表现出良好的除草剂抗性,而对照组几乎全部死亡,证明抗除草剂基因CP4-epsps专入棉花体内并进行了表达。(6)室内种植部分转基因棉花株系,对其进行15%PEG6000 和 200mmol/LNaCl处理,观察表型变化,同时通过干旱和盐胁迫下相关生理指标的分析得出,干旱和高盐胁迫下,转基因棉花的长势明显优与对照组,转KcERF-PeDREB基因棉花体内的MDA含量显著低于对照组,C AT、SOD活性和游离脯氨酸含量均高于对照组,同时,与对照组相比,转基因棉花的根系更发达,种子饱满度更高。通过qPCR分析胁迫后棉株KcERF和PeDREB2a基因表达量,发现干旱和盐胁迫均可诱导外源PeDREB、KcERF基因超表达。综上,PeDREB、KcERF基因提高了棉花的耐旱、耐盐能力。
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