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目的：肝硬化肾功能损害是肝硬化患者死亡的重要原因之一，表现为自发性少尿或无尿、氮质血症、稀释性低血钠和低尿钠等。肝硬化时肾功能损害的原因未明，可能由于严重的肝功能障碍而导致肾脏的血流动力学改变所致。肝硬化时肾脏血流动力学改变的特征是：肾内血管收缩，肾血流量重新分布，血流自肾皮质向髓质分流，肾皮质缺血，肾小球入球小动脉收缩，肾小球滤过率下降。尽管此时体循环扩血管因子可因过度产生和灭活障碍而升高 ,但在肾脏缩血管因子活性却占优势。因而 ,随着肝硬化病程加深 ,肾血管收缩逐渐加剧 ,肾血管阻力大大增加 ,导致肾血流灌注量和肾小球滤过率降低 ,最终导致进行性少尿、无尿、血肌酐和尿素氮水平升高 ,产生肝肾综合征。近年来研究发现一氧化碳（Carbon monoxide, CO）同一氧化氮(Nitric oxide, NO)一样，也是一种重要的气体信使分子，除参与中枢神经系统的信号传递外，它在血管张力调节中也起重要作用。这一发现促使我们来研究一氧化碳是否也参与了肝硬化时肾脏血管的调节。HO是血红素分解代谢的限速酶，催化血红素转化成为等分子量的胆绿素、一氧化碳和游离铁。本研究旨在分别应用血红素氧合酶-1（HO-1）的促进剂氯高血红素（Hemin）和拮抗剂锌原卟啉(ZnPP)来研究血<WP=4>红素氧合酶—一氧化碳系统对肝硬化大鼠肾脏血流动力学的影响。方法：1.模型制备与分组：本研究采用40%四氯化碳皮下注射5%乙醇代水饮复合方法制作肝硬化模型，将雄性Sprague Dawley大鼠随机分为正常对照组,肝硬化组，肝硬化＋Hemin组，肝硬化＋ZnPP组。2.血流动力学测定：应用盐酸氯氨酮麻醉大鼠，打开腹腔分离门静脉、肠系膜上动脉、肾动脉。用5.5号头皮针进行肠系膜上动脉、门静脉插管，连接压力换能器（YP-100型，保定），应用八道生理记录仪测量门脉压力（portal venous pressure，PVP）、平均动脉压（mean arterial pressure，MAP），应用电磁流量计测定肾动脉血流量（renal arterial blood flow，RABF）等血流动力学指标。3.组织学检查：⑴免疫组织化学检查：病理学采用10%多聚甲醛固定、石蜡包埋的肾脏组织切片，厚度5μm。脱蜡至水，用3%过氧化氢（H2O2）孵育30min，以消除内源性过氧化物酶的活性。抗原修复：本实验室选用的是石蜡切片热修复操作方法，即将切片放入盛有抗原修复液（枸橼酸盐缓冲液）的容器中，置电炉上加热使容器内液体温度保持在92℃～94℃之间并持续40min。取出容器，室温冷却20～30min。加10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，37℃孵育40min。倾去血清，勿洗，滴加一抗（1：50兔多克隆抗HO-1抗体），4℃过夜。滴加适当比例稀释的生物素标记的二抗（1：100羊抗兔IgG），37℃孵育，30min。滴加1：100稀释的辣根酶标记的链酶卵白素，37℃孵育30min。用3，3-二氨基苯联胺（DAB）显色，自来水充分冲洗。复染后封片。细胞胞浆呈现黄褐色或黄褐色颗粒为阳性细胞。用病理图象分析<WP=5>系统对HO-1蛋白水平进行定量分析。⑵HO-1 Western blotting分析：将组织匀浆后放入含PMSF的细胞裂解液中，冰上放置1h，12000rpm、4℃离心15min，吸取上清置于另一容器，沉淀弃去。应用考马斯亮兰进行蛋白定量。取220μg样品蛋白行10%SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离后，水浴式恒压90V电转膜至硝酸纤维素膜。应用脱脂奶粉进行封闭，4℃过夜。加入 1：50稀释的兔多克隆抗HO-1抗体（博士德，武汉），37℃孵育6h。与辣根酶标记的二抗（羊抗兔IgG，北京中山公司）37℃孵育2h，洗膜后应用DAB进行显色，以出现棕黄色条带为阳性结果。结果：⑴与正常对照组相比，肝硬化组大鼠RABF显著下降[(3.57±0.03)ml·min-1/100g vs. (3.87±0.10) ml·min-1/100g P＜0.01]，PVP明显升高[(2.56±0.35)kPa vs. (1.52±0.52)kPa，P＜0.01]，MAP明显降低[(12.92±0.76)kPa vs. (16.39±0.60)kPa，P＜0.01]。⑵肝硬化+锌原卟啉组大鼠，MAP升高[(14.36±0.51)kPa vs.(12.92±0.76)kPa，P＜0.01]，PVP下降[(2.02±0.06)kPa vs. (2.56±0.35)kPa，P＜0.01]，肾动脉血流量进一步降低[(3.52±0.08) ml·min-1/100g vs. (3.57±0.03) ml·min-1/100g，P＜0.01]。⑶肝硬化+氯高血红素组大鼠，MAP降低[(12.19±0.68) kPa vs. (12.92±0.76)kPa，P＜0.05]，RABF升高[(3.79±0.05)ml·min-1/100g vs. (3.57±0.03) ml·min-1/100g，P＜0.01]，但没有达到正常对照组水平[(3.79±0.05)ml·min-1/100g vs. (3.87±0.10) ml·min-1/ 100g ，P＜0.05]。⑷ HO-1免疫组织化学染色：HO-1阳性表达定位于细胞浆内，为棕黄色染色，在高倍镜下观察呈细<WP=6>颗粒状。在正常大鼠的肾脏，HO-1主要定位于肾皮质的远端、近端小管，在髓质则多分布于集合管和髓襻；与正常大鼠肾脏相比，肝硬化大鼠肾脏HO-1阳性细胞数目及细胞浆内黄染颗粒减少，阳性面积明显减少(0.45±0.04 vs. 0.81±0.05，P＜0.01)；应用ZnPP后HO-1阳性面积更低(0.36±0.02 vs. 0.45±0.04，P＜0.01)；应用Hemin后HO-1阳性面积略升高(0.54±0.04 vs. 0.45±0.04，P＜0.01)。⑸ HO-1Western blotting分析：Western blotting 分析在大概31KD的位置上出现一条杂交带见Fig. 5，