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Piezo机械门控离子通道(Piezo mechano-gated ion channel)是在2010年由Coste等发现并克隆。该通道家族含有Piezo1和Piezo2两个成员，它们在包括膀胱、结肠和肺等多种组织中表达，Piezo2在背根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)表达丰富。Piezo通道可被机械力直接激活，产生快激活、失活动力学多变的机械及门控电流。其中Piezo2机械门控电流具有快激活、快失活特征(Rapidlyadapting，RA，失活时间常数τ＜10ms)。Piezo通道是唯一公认的哺乳动物机械门控离子通道，近年来，其结构、生物物理特性、功能调节等的研究及其生理学和病理生理学意义得到越来越多的揭示。
条件性敲除小鼠DRG感觉神经元Piezo2通道使其低阈值触觉显著受损。Piezo2功能缺失性突变可导致人的无毛皮肤低阈值触觉丧失、两点触摸分辨能力下降等。抑制或敲除DRG神经元Piezo2通道可消除炎性痛或神经病理性疼痛动物的机械性痛觉异常(Mechanical allodynia，MA)。因此，Piezo2生理状态下介导哺乳动物的低阈值触觉(Low-threshold touch sensation)，病理情况下介导由低阈值触觉诱发的MA。然而，目前虽已确认Piezo2是介导MA的分子基础，但其确切分子机制仍属未知。
我们的前期研究证实，细胞内高渗液(Hyper-osmolarity)或细胞外低渗液(Hypo-osmolarity)促使细胞膨胀，可显著增大DRG神经元细胞膜张力，同时显著增大其Piezo2/RA电流，动物脚掌注射低渗液可诱发MA。细胞膜张力变化是Piezo2通道功能调节的重要分子基础。利用不稳定波动分析可知，在DRG神经元细胞膜张力显著增大时，Piezo2单通道电流虽有增大趋势却无显著性差异，而细胞膜上Piezo2通道的数目却增大约4倍。我们利用Westernblot技术检测低渗液孵育DRG神经元后Piezo2的总表达量，无显著变化。因此，我们推测，在未见DRG感觉神经元Piezo2通道总表达量显著上调的情况下，其细胞膜张力显著增大，促使膜上Piezo2通道的数量显著上调，可能介导了炎症或神经病理性损伤时MA的产生。这显然是动员了某种储备形式的Piezo2，使之膜转位增加所致。那么Piezo2储备在哪儿呢？
凹陷小窝(Caveolae)是典型的细胞膜内陷结构，呈烧瓶状或开口杯状，“瓶身”宽60-80nm，长不超过100nm，也被人认为是脂筏(Lipid rafts )的主要结构，富含胆固醇和鞘磷脂成分。网格蛋白小窝(Clathrin-coated pits，CCP)类似，宽60-120nm，长不超过150nm，因网格蛋白(Clathrin，Cla)包裹而得名，富含磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI(4,5)P2)。一方面二者是许多信号分子、营养物质等内化(内吞)进入细胞的重要机制和途径，小窝蛋白(Caveolin，含Caveolin-1、-2和-3三个亚型)和网格蛋白分别是二者内化的装配启动分子。另一方面二者是细胞膜的“备胎”，即正常时作为细胞膜的储备(Membrane reservoir)，必要时可补充细胞膜。在细胞膜张力急剧增大时，二者可中止内化、外翻上膜并被拉平(flattening)以补充细胞膜，缓冲细胞膜张力增大，保持细胞膜完整而不被撕裂；信号分子等也随之上膜。
综上所述，我们猜想Piezo2可能隐藏于DRG神经元的细胞膜内陷结构如凹陷小窝或网格蛋白小窝中。正常情况下，细胞膜Piezo2通道接受机械刺激介导低阈值触觉，内陷结构中的Piezo2通道因不能接受有效机械刺激不能表现功能；当细胞膨胀、炎症或神经损伤时，DRG神经元细胞膜张力显著增大，促使凹陷小窝或者网格蛋白小窝结构中的Piezo2通道外翻上膜，使细胞膜Piezo2通道数目显著增加，接受有效机械刺激显著增强Piezo2/RA电流而介导MA。本课题将分为两部分对DRG神经元Piezo2机械门控通道的膜动力学及其在疼痛中的作用进行研究。
第一部分DRG神经元Piezo2通道膜动力学研究
目的：研究Piezo2通道在凹陷小窝和/或网格蛋白小窝的分布；研究在促进内化或上膜的因素的作用下，Piezo2随小窝内化或上膜的膜动力学过程及调控机制。
方法：(1)以Caveolin-1和Clathrin分别为凹陷小窝和网格蛋白小窝标志物，利用激光扫描共聚焦显微镜技术(LSCM)和全内反射激光共聚焦显微镜技术(TIRFM)、超高分辨率显微镜技术(STORM)和荧光共振能量转移技术(FRET)等研究Piezo2和Caveolin-1或Clathrin的细胞共定位关系及相互作用。
(2)利用LSCM、TIRF、STORM和免疫蛋白印迹(Western Blot，WB)等技术，研究Piezo2通道随小窝内化或上膜的膜动力学过程及其调控机制；研究Piezo2通道在DRG神经元的表达变化。
(3)利用膜片钳电生理技术，研究Piezo2通道膜动力学对Piezo2/RA电流的影响。
结果：1.已知KCNQ2与KCNQ3能形成共定位，KCNQ2与KCNQ4不能形成共定位。利用Q2+Q3为阳性对照、Q2+Q4为阴性对照，验证STORM系统运行情况。实验结果显示KCNQ2与KCNQ3存在明显的共定位，KCNQ2与KCNQ4不存在共定位情况，说明我室STORM系统运行正常，可用于实验。
2.STORM技术、LSCM/TIRF技术和FRET技术证明了Piezo2和Clathrin，Piezo2和Caveolin-1存在明显的共定位情况。FRET现象以及STORM峰值在20nm到100nm之间，说明Piezo2分别和Clathrin、Caveolin-1定位良好且可能有相互作用。
3.促进内化因素CD孵育DRG神经元，Clathrin、Caveolin-1和Piezo2都趋于内化，在胞浆分布显著增多，在细胞膜分布显著减少。促进上膜因素Dynasore、Hypo-osmolarity和MBCD孵育DRG神经元，Clathrin和Caveolin-1向细胞膜上显著聚集，胞浆分布显著减少，Piezo2向细胞膜上显著聚集，胞浆分布显著减少。CPZ(chlorpromazine)可选择性抑制CCP形成而促进上膜，孵育DRG神经元可见Clathrin在膜上显著聚集，Piezo2也向细胞膜显著聚集。WB技术证明在上述因素作用下DRG神经元Piezo2通道蛋白无表达变化。
4.膜片钳电生理技术发现Dynasore使DRG神经元的Piezo2/RA电流显著增大。
结论：1.KCNQ2与KCNQ3存在明显的共定位作为阳行对照，KCNQ2与KCNQ4不存在共定位情况作为阴性对照。证明我们STORM工作站运行的稳定性，染料对的特异性和数据的可靠性。
2.LSCM/TIRF、FRET以及STORM数据表明，正常情况下，DRG神经元Piezo2与Clathrin或Caveolin-1均有共定位，可能具有相互作用。促进内化或上膜的因素作用下，DRG神经元Piezo2随小窝内化或上膜显著增加，而且未见Piezo2通道蛋白显著性表达变化，说明Piezo2通道具有内化或上膜的膜动力学过程且呈动态平衡。
3.电生理数据表明，Piezo2/RA电流随通道蛋白膜动力学的变化而变化。
第二部分Piezo2通道膜动力学改变介导CFA炎症模型动物的机械性痛觉异常
目的：利用NGF或炎性汤(PGE2、5-HT、BK、His的混合物)孵育DRG神经元，在离体的细胞学水平模拟炎症发生；脚掌注射CFA制备慢性炎性痛动物模型，观察Piezo2膜动力学改变及其介导MA情况。
方法：(1)NGF或炎性汤孵育DRG神经元，观察Piezo2、Clathrin和Caveolin-1的膜动力学变化。
(2)SD大鼠脚掌注射CFA制备炎症动物模型，利用纤毛刺痛针和热致痛仪测量动物痛觉行为学，并测量注射CFA部位脚掌肿胀的体积。
(3)利用LSCM/TIRF和STORM技术观察CFA炎症大鼠DRG神经元Piezo2通道的的膜动力学变化。
(4)NGF或炎性汤孵育DRG神经元后，膜片钳电生理技术观察Piezo2/RA电流的变化；CFA炎症模型大鼠DRG神经元Piezo2/RA电流的变化。
结果：1.LSCM/TIRF及STORM数据表明，NGF或炎性汤孵育DRG神经元可使Piezo2、Clathrin及Caveolin-1显著上膜。
2.SD大鼠左后、右后脚掌同时注射CFA并在0小时、6小时、24小时、48小时和72小时分别测量大鼠的触痛阈值、热痛阈和脚掌的体积，脚掌注射NS为阴性对照。结果显示CFA组的热痛阈和触痛阈值均显著降低，热痛阈在24小时达到最低值，触痛阈在第6小时最低。并且CFA组的大鼠脚掌肿胀程度比对照组高。
3.LSCM/TIRF和STORM结果显示Piezo2在胞膜上显著聚集，Clathrin和Caveolin-1均在胞膜显著聚集。
结论：1.NGF或炎性汤孵育DRG神经元后，Piezo2膜动力学发生改变，上膜显著增加。
2.通过刺痛、热痛的结果显示CFA炎性疼痛模型成功，可以用于后续实验。
3.在CFA炎性疼痛模型中，Piezo2通道分布在胞膜上增多，介导MA产生。
条件性敲除小鼠DRG感觉神经元Piezo2通道使其低阈值触觉显著受损。Piezo2功能缺失性突变可导致人的无毛皮肤低阈值触觉丧失、两点触摸分辨能力下降等。抑制或敲除DRG神经元Piezo2通道可消除炎性痛或神经病理性疼痛动物的机械性痛觉异常(Mechanical allodynia，MA)。因此，Piezo2生理状态下介导哺乳动物的低阈值触觉(Low-threshold touch sensation)，病理情况下介导由低阈值触觉诱发的MA。然而，目前虽已确认Piezo2是介导MA的分子基础，但其确切分子机制仍属未知。
我们的前期研究证实，细胞内高渗液(Hyper-osmolarity)或细胞外低渗液(Hypo-osmolarity)促使细胞膨胀，可显著增大DRG神经元细胞膜张力，同时显著增大其Piezo2/RA电流，动物脚掌注射低渗液可诱发MA。细胞膜张力变化是Piezo2通道功能调节的重要分子基础。利用不稳定波动分析可知，在DRG神经元细胞膜张力显著增大时，Piezo2单通道电流虽有增大趋势却无显著性差异，而细胞膜上Piezo2通道的数目却增大约4倍。我们利用Westernblot技术检测低渗液孵育DRG神经元后Piezo2的总表达量，无显著变化。因此，我们推测，在未见DRG感觉神经元Piezo2通道总表达量显著上调的情况下，其细胞膜张力显著增大，促使膜上Piezo2通道的数量显著上调，可能介导了炎症或神经病理性损伤时MA的产生。这显然是动员了某种储备形式的Piezo2，使之膜转位增加所致。那么Piezo2储备在哪儿呢？
凹陷小窝(Caveolae)是典型的细胞膜内陷结构，呈烧瓶状或开口杯状，“瓶身”宽60-80nm，长不超过100nm，也被人认为是脂筏(Lipid rafts )的主要结构，富含胆固醇和鞘磷脂成分。网格蛋白小窝(Clathrin-coated pits，CCP)类似，宽60-120nm，长不超过150nm，因网格蛋白(Clathrin，Cla)包裹而得名，富含磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI(4,5)P2)。一方面二者是许多信号分子、营养物质等内化(内吞)进入细胞的重要机制和途径，小窝蛋白(Caveolin，含Caveolin-1、-2和-3三个亚型)和网格蛋白分别是二者内化的装配启动分子。另一方面二者是细胞膜的“备胎”，即正常时作为细胞膜的储备(Membrane reservoir)，必要时可补充细胞膜。在细胞膜张力急剧增大时，二者可中止内化、外翻上膜并被拉平(flattening)以补充细胞膜，缓冲细胞膜张力增大，保持细胞膜完整而不被撕裂；信号分子等也随之上膜。
综上所述，我们猜想Piezo2可能隐藏于DRG神经元的细胞膜内陷结构如凹陷小窝或网格蛋白小窝中。正常情况下，细胞膜Piezo2通道接受机械刺激介导低阈值触觉，内陷结构中的Piezo2通道因不能接受有效机械刺激不能表现功能；当细胞膨胀、炎症或神经损伤时，DRG神经元细胞膜张力显著增大，促使凹陷小窝或者网格蛋白小窝结构中的Piezo2通道外翻上膜，使细胞膜Piezo2通道数目显著增加，接受有效机械刺激显著增强Piezo2/RA电流而介导MA。本课题将分为两部分对DRG神经元Piezo2机械门控通道的膜动力学及其在疼痛中的作用进行研究。
第一部分DRG神经元Piezo2通道膜动力学研究
目的：研究Piezo2通道在凹陷小窝和/或网格蛋白小窝的分布；研究在促进内化或上膜的因素的作用下，Piezo2随小窝内化或上膜的膜动力学过程及调控机制。
方法：(1)以Caveolin-1和Clathrin分别为凹陷小窝和网格蛋白小窝标志物，利用激光扫描共聚焦显微镜技术(LSCM)和全内反射激光共聚焦显微镜技术(TIRFM)、超高分辨率显微镜技术(STORM)和荧光共振能量转移技术(FRET)等研究Piezo2和Caveolin-1或Clathrin的细胞共定位关系及相互作用。
(2)利用LSCM、TIRF、STORM和免疫蛋白印迹(Western Blot，WB)等技术，研究Piezo2通道随小窝内化或上膜的膜动力学过程及其调控机制；研究Piezo2通道在DRG神经元的表达变化。
(3)利用膜片钳电生理技术，研究Piezo2通道膜动力学对Piezo2/RA电流的影响。
结果：1.已知KCNQ2与KCNQ3能形成共定位，KCNQ2与KCNQ4不能形成共定位。利用Q2+Q3为阳性对照、Q2+Q4为阴性对照，验证STORM系统运行情况。实验结果显示KCNQ2与KCNQ3存在明显的共定位，KCNQ2与KCNQ4不存在共定位情况，说明我室STORM系统运行正常，可用于实验。
2.STORM技术、LSCM/TIRF技术和FRET技术证明了Piezo2和Clathrin，Piezo2和Caveolin-1存在明显的共定位情况。FRET现象以及STORM峰值在20nm到100nm之间，说明Piezo2分别和Clathrin、Caveolin-1定位良好且可能有相互作用。
3.促进内化因素CD孵育DRG神经元，Clathrin、Caveolin-1和Piezo2都趋于内化，在胞浆分布显著增多，在细胞膜分布显著减少。促进上膜因素Dynasore、Hypo-osmolarity和MBCD孵育DRG神经元，Clathrin和Caveolin-1向细胞膜上显著聚集，胞浆分布显著减少，Piezo2向细胞膜上显著聚集，胞浆分布显著减少。CPZ(chlorpromazine)可选择性抑制CCP形成而促进上膜，孵育DRG神经元可见Clathrin在膜上显著聚集，Piezo2也向细胞膜显著聚集。WB技术证明在上述因素作用下DRG神经元Piezo2通道蛋白无表达变化。
4.膜片钳电生理技术发现Dynasore使DRG神经元的Piezo2/RA电流显著增大。
结论：1.KCNQ2与KCNQ3存在明显的共定位作为阳行对照，KCNQ2与KCNQ4不存在共定位情况作为阴性对照。证明我们STORM工作站运行的稳定性，染料对的特异性和数据的可靠性。
2.LSCM/TIRF、FRET以及STORM数据表明，正常情况下，DRG神经元Piezo2与Clathrin或Caveolin-1均有共定位，可能具有相互作用。促进内化或上膜的因素作用下，DRG神经元Piezo2随小窝内化或上膜显著增加，而且未见Piezo2通道蛋白显著性表达变化，说明Piezo2通道具有内化或上膜的膜动力学过程且呈动态平衡。
3.电生理数据表明，Piezo2/RA电流随通道蛋白膜动力学的变化而变化。
第二部分Piezo2通道膜动力学改变介导CFA炎症模型动物的机械性痛觉异常
目的：利用NGF或炎性汤(PGE2、5-HT、BK、His的混合物)孵育DRG神经元，在离体的细胞学水平模拟炎症发生；脚掌注射CFA制备慢性炎性痛动物模型，观察Piezo2膜动力学改变及其介导MA情况。
方法：(1)NGF或炎性汤孵育DRG神经元，观察Piezo2、Clathrin和Caveolin-1的膜动力学变化。
(2)SD大鼠脚掌注射CFA制备炎症动物模型，利用纤毛刺痛针和热致痛仪测量动物痛觉行为学，并测量注射CFA部位脚掌肿胀的体积。
(3)利用LSCM/TIRF和STORM技术观察CFA炎症大鼠DRG神经元Piezo2通道的的膜动力学变化。
(4)NGF或炎性汤孵育DRG神经元后，膜片钳电生理技术观察Piezo2/RA电流的变化；CFA炎症模型大鼠DRG神经元Piezo2/RA电流的变化。
结果：1.LSCM/TIRF及STORM数据表明，NGF或炎性汤孵育DRG神经元可使Piezo2、Clathrin及Caveolin-1显著上膜。
2.SD大鼠左后、右后脚掌同时注射CFA并在0小时、6小时、24小时、48小时和72小时分别测量大鼠的触痛阈值、热痛阈和脚掌的体积，脚掌注射NS为阴性对照。结果显示CFA组的热痛阈和触痛阈值均显著降低，热痛阈在24小时达到最低值，触痛阈在第6小时最低。并且CFA组的大鼠脚掌肿胀程度比对照组高。
3.LSCM/TIRF和STORM结果显示Piezo2在胞膜上显著聚集，Clathrin和Caveolin-1均在胞膜显著聚集。
结论：1.NGF或炎性汤孵育DRG神经元后，Piezo2膜动力学发生改变，上膜显著增加。
2.通过刺痛、热痛的结果显示CFA炎性疼痛模型成功，可以用于后续实验。
3.在CFA炎性疼痛模型中，Piezo2通道分布在胞膜上增多，介导MA产生。