肝纤维化（Hepatic fibrosis,HF）是多种损伤因子所致的慢性肝炎到肝硬化必经的病理过程,表现为以胶原蛋白为主的大量细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）异常累积在肝脏,进一步引发纤维结缔组织过度增生,形成瘢痕间隔分割正常的肝小叶结构,最终导致假小叶的形成。严格的说,肝纤维化的发病过程及其隐匿,临床症状不明显,经常被发现时已处于肝硬化阶段。因此,以肝纤维化的发展为突破口,探究其病理过程中的分子机制有利于为开发早期诊断的生物分子标志物提供思路。研究表明,由肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）活化成为的肌成纤维细胞会分泌大量的ECM组分,因此HSCs的活化与增殖被认为是HF发生的中心环节。越来越多的研究报道,非编码RNA（noncoding RNAs,nc RNAs）参与HSCs的活化与增殖过程,其中微小RNA（micro RNA,miRNA）以及长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）通过调控肝纤维化中关键基因的表达参与其进展过程,并且它们的临床意义相继被报道。近几年,高通量测序及生物信息分析技术的进步,使得环状RNA（circular RNA,circRNA）在不同疾病中的表达谱及分子功能逐渐被揭晓。值得关注的是,我们前期的研究通过高通量测序的方法建立了circRNA在肝纤维化小鼠的原代HSCs表达谱,并且发现circ FBXW4通过靶向mi R-18b-3p/FBXW7轴抑制HF的进展。但有关circRNA在HF过程中的功能尚不清楚。在我们的测序结果中,与对照组的小鼠相比,源于宿主基因PSD3（Pleckstrin and Sec7domain-containing 3）的circPSD3在小鼠HF的原代HSCs中异常下降。查阅相关文献,我们了解到保守的circRNAs在肝脏疾病中的重要功能逐渐被发现,circPSD3则是一个保守的circRNA,在人与小鼠中均由8号染色体上PSD3基因的5个连续的外显子经过反向剪接形成。然而circPSD3在HF中的作用尚未有人报道。近年来,越来越多的研究关注因肝脏基因异常引起的疾病的基因治疗（Gene Therapy,GT）。GT是一种通过将外源性核酸经过合适的载体包装导入体细胞,纠正异常改变基因的表达水平,进而达到治疗目的的方法。腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）载体是一种用于GT的常用载体,具有较高的安全性、出色的基因转导能力、较低的免疫原性、及介导基因表达的长效性等优点,其介导的GT被相继应用于临床试验。重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus,r AAV）载体的建立是将目的基因序列替换掉其本身的基因组序列,然后将该载体与决定AAV血清型的载体、辅助载体共同转染AAV-293T细胞,生产出特定血清型的r AAV载体。不同血清型的AAV载体对器官或组织的趋向性不同。研究报道,AAV8具有突出的肝脏趋向性、介导基因长期表达、低免疫原性及一定的临床应用前景,并且其介导的GT在小鼠肝纤维化中取得了较好的效果。然而,AAV8介导的circRNA递送系统用于HF的研究尚未有人报道。因此,本研究首先建立r AAV载体介导的circPSD3递送系统,为后期研究circPSD3在小鼠肝纤维化中的功能提供在体研究工具;接着,在小鼠肝纤维化模型及人的肝纤维化样本中验证circPSD3的表达水平,进一步明确circPSD3在何种肝脏细胞中表达差异最为明显;并通过体内及体外实验研究circPSD3对肝纤维化进程的影响及可能的作用机制。方法:1.首先通过circBase网站获取circPSD3的全长序列,然后设计针对circPSD3的特异性引物扩增目的片段,并将其导入pHBAAV-CMV-Zs Green1载体中,使用酶切载体及全长测序的方法确定载体是否成功建立。通过“三质粒系统”转染AAV-293T细胞,获得含有病毒颗粒的细胞,通过反复冻融细胞,离心收集上清,获得粗病毒,进一步纯化病毒并进行质控检测。最后通过尾静脉注射病毒到小鼠体内,观察病毒是否对小鼠有毒性,及病毒在小鼠体内的主要器官分布。2.通过小鼠腹腔长期注射四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）及胆总管结扎（Bile duct ligation,BDL）手术建立不同病因引起的肝纤维化模型,检测病理学指标、血清肝损伤指标及肝纤维化相关指标,确定肝纤维化模型是否建立成功。进一步提取肝脏总RNA,运用q-PCR技术检测circPSD3的表达。3.通过原位肝脏灌流技术提取小鼠的原代肝细胞、HSCs及巨噬细胞,进一步提取细胞总RNA,通过q-PCR检测circPSD3的表达。4.收集人的肝纤维化样本,通过病理学证实后,提取总RNA,通过q-PCR检测circPSD3的表达。5.通过尾静脉注射给予小鼠一定量的r AAV载体介导的circPSD3或空载体病毒,1周后,再进行为期6周CCl4诱导的肝纤维化造模,通过检测病理学指标、血清指标及肝纤维化相关指标,探究circPSD3在肝纤维化进程中的功能。6.通过RNase R酶消化实验和放线菌素（Actinomycin D）耐受实验检测circPSD3的稳定性,同时通过RNA荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验及核质分离实验确定circPSD3的亚细胞定位。7.体外,通过10 ng/mL TGF-β1刺激人的肝星状细胞株LX-2模拟体内HSCs的活化过程,提取细胞总RNA,运用q-PCR检测circPSD3的表达。8.在LX-2细胞中,通过慢病毒载体介导的circPSD3过表达及新型阳离子脂质体介导的si-circPSD3敲低技术探究circPSD3的功能,运用western blot,q-PCR,流式细胞术,CCK8法及EdU点击实验检测细胞活化及增殖相关指标。9.采用miRNA测序技术检测因circPSD3过表达发生差异改变的miRNA,进一步通过靶点预测网站,q-PCR,及双荧光酶实验验证与circPSD3可能发生结合的miRNA。10.将miRNA mimics转染至稳定高表达circPSD3的LX-2细胞中,运用q-PCR,western blot,CCK8法及EdU点击实验检测miRNA对circPSD3功能的影响。结果:1.酶切载体及序列全长测序的结果显示pHBAAV-CMV-Zs Green1-circPSD3重组载体建立成功。经过病毒包装、纯化,成功构建了AAV8介导的circPSD3递送系统（AAV8-circPSD3）,质控检测的结果显示,AAV8-circPSD3无细菌及真菌和支原体感染,滴度在理想的范围内。发现AAV8-circPSD3集中分布在小鼠肝脏中,并且其本身对小鼠肝脏无毒性。2.circPSD3在CCl4及BDL诱导的小鼠肝纤维化中异常降低。3.circPSD3在肝纤维化小鼠的原代HSCs中显著降低。4.与正常组的肝脏样本相比,circPSD3在收集的人肝纤维化样本中显著降低。5.与AAV8空载体病毒组相比,AAV8-circPSD3明显减轻了CCl4诱导的小鼠肝纤维化程度,表现为血清ALT及AST水平、肝脏胶原沉积及炎症反应的显著降低。并且效果优于慢病毒载体介导的circPSD3递送系统。6.与线性的PSD3相比,circPSD3明显能耐受RNase R的消化作用及Actinomycin D的作用,RNA FISH实验及核质分离实验证明circPSD3位于细胞质中。7.circPSD3在活化的LX-2细胞中明显下降。8.慢病毒载体介导的circPSD3过表达明显抑制LX-2细胞的活化与增殖,相反,敲低circPSD3明显促进LX-2细胞的活化与增殖。9.miRNA测序结果表明,过表达circPSD3明显抑制了mi R-92b-3p的表达水平,Star Base网站预测circPSD3与mi R-92b-3p有一个理想的结合位点,q-PCR及双荧光素酶实验的结果证明circPSD3能够与mi R-92b-3p发生结合。10.过表达mi R-92b-3p明显减弱了circPSD3抑制LX-2细胞的活化及增殖效果,并且抑制了circPSD3对Smad7的促进效果。结论:综上所述,本研究成功建立了重组AAV载体介导的circPSD3递送系统,并发现circPSD3通过靶向mi R-92b-3p/Smad7轴发挥抗肝纤维化的功能。重组腺相关载体介导的circRNA递送系统为实现以circPSD3为靶点的基因治疗提供了思路,为开发早期诊断肝纤维化的生物标志物奠定了前期基础。