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研究背景流行性感冒是由流感病毒感染所导致的急性气道炎症性疾病,可导致高热、咳嗽、胸痛、乏力、头痛、肌肉酸痛等症状,对于存在慢性气道炎症性疾病的人群,流感病毒感染后更容易发展为重症病例,死亡风险显著增高。慢性气道炎症性疾病主要包括慢性阻塞性肺疾病和支气管哮喘,本课题组先前研究已证实流感病毒是导致我国慢性阻塞性肺疾病急性加重的主要病原体,故关于流感病毒诱发慢性气道炎症性疾病急性加重发病机制的研究至关重要。维持自噬和凋亡的平衡在病毒感染所导致疾病的严重程度及预后中具有重要意义,自噬在病毒感染中发挥双重调节作用,一方面病毒可以在自噬小体双层膜结构的保护下进行复制,另一方面自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体,溶酶体内的酶降解病毒后,将病毒的抗原提呈给免疫细胞,以激活机体的免疫反应。在正常生理过程中细胞通过凋亡清除损伤或衰老的细胞器以维持机体的稳态,当机体受到病原体侵袭后,细胞凋亡会激活炎症反应产生免疫应答,但病毒在自噬小体内复制后通过细胞凋亡完成病毒的释放,以感染周围邻近细胞,目前国内外尚无关于流感病毒诱发的慢性气道炎症性疾病急性加重中自噬和凋亡以及其相互调控机制的研究。褪黑素是由下丘脑松果体分泌的胺类激素,其在改善睡眠,抗衰老,调节免疫等方面均可发挥作用,研究发现褪黑素在抗病毒方面可发挥免疫调节作用,故本研究目的旨在探讨自噬和凋亡在流感病毒诱发气道炎症中的分子作用机制,以及褪黑素能否通过Sirt1差异调节自噬和凋亡在流感病毒诱发气道炎症中发挥免疫调节作用。研究方法体外实验用流感病毒感染DHBE（病变气道上皮）细胞后,采用western blotting检测DHBE细胞中Sirt1的表达水平;细胞的自噬水平的测定采用了:western blotting检测自噬相关蛋白Beclin1,LC3B表达、电镜观察细胞内的自噬小体、荧光共聚焦显微镜观察m RFP-GFP-LC3腺病毒标记LC3,示踪自噬形成以及自噬流的变化;细胞凋亡水平的检测方法为:western blotting测定凋亡相关蛋白Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡水平;ELISA检测细胞培养液上清中炎症因子IL-8以及TNF-α表达水平。褪黑素预处理DHBE细胞4小时后再感染流感病毒,检测自噬、凋亡水平及相关炎症指标的变化情况。为了进一步研究褪黑素在流感病毒诱发的气道炎症中的作用机制,使用慢病毒对Sirt1敲减及过表达,褪黑素预处理4小时再感染流感病毒,检测自噬,凋亡及相关炎症指标的变化情况。体内实验使用6-8周龄,体重约20-25g的雄性C57BL/6小鼠,小鼠烟草烟雾暴露6个月,褪黑素组小鼠在流感病毒感染前28天每天腹腔注射褪黑素20mg/kg,麻醉小鼠后气道内滴入流感病毒悬液70微升。流感病毒感染一周后用硫喷妥钠麻醉小鼠,心脏取血离心后收集血清,进行肺泡灌洗收集BALF,并取出小鼠肺组织,western blotting检测了肺组织中Sirt1、Beclin1、LC3B、Bax和Bcl-2蛋白的表达水平,免疫荧光检测Sirt1以及LC3B的表达,ELISA检测了小鼠血清及BALF中IL-8、TNF-α水平。研究结果实验结果显示流感病毒感染后Sirt1表达水平显著升高,12小时达峰值后逐渐降低;自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达逐渐升高至24小时达峰值后下降;凋亡相关蛋白表达结果则显示:细胞的凋亡水平在流感病毒感染后48小时达高峰;流感病毒感染后细胞上清中IL-8以及TNF-α水平逐渐增高,48小时达高峰。以上结果表明流感病毒感染后细胞的自噬和凋亡水平均增高,且自噬水平达峰值的时间明显早于凋亡水平达峰值的时间,但是流感病毒感染后细胞自噬和凋亡之间的相互调节关系尚不明确,故在流感病毒感染前使用自噬早期抑制剂3-MA、自噬晚期抑制剂CQ、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK进行预处理,结果显示自噬抑制剂3-MA预处理后自噬被抑制,凋亡水平随之减少,可能与病毒载量相关,抑制自噬小体形成后病毒在细胞内复制受限,细胞内病毒载量降低,细胞凋亡水平随之减少。自噬晚期抑制剂CQ具有抑制自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体的作用,导致自噬小体以及大量待降解物质在细胞内累积,诱发内质网应激,导致细胞凋亡发生。凋亡抑制剂Z-VAD-FMK预处理后细胞凋亡被抑制,大量自噬小体在细胞内出现累积,表现为自噬水平增高。为了探讨褪黑素在上述机制中是否发挥作用,首先用褪黑素预处理DHBE细胞后再感染流感病毒,与未使用褪黑素预处理组相比,褪黑素预处理后自噬水平显著升高,细胞凋亡被抑制,且炎症因子IL-8、TNF-α水平明显降低。进一步研究褪黑素对自噬、凋亡以及炎症水平调控的作用机制,使用慢病毒对Sirt1敲低或过表达,褪黑素预处理4小时候再感染流感病毒,与NC组相比,慢病毒敲低Sirt1组中褪黑素对自噬的促进、凋亡的抑制以及降低炎症水平的作用显著减弱,但在Sirt1过表达组褪黑素显著增强自噬、抑制凋亡以及降低炎症水平的作用明显增强,以上实验结果有力地证明褪黑素通过Sirt1差异调节自噬和凋亡,在流感病毒诱发的气道炎症中发挥预防作用。研究结论1、在流感病毒诱发气道炎症中自噬发生的时间显著早于凋亡,并且自噬和凋亡之间存在相互调控关系。2、Sirt1参与流感病毒诱发的气道炎症,并参与调节流感病毒感染气道上皮细胞的自噬和凋亡。3、褪黑素通过Sirt1差异调节自噬和凋亡在流感病毒诱发气道炎症中发挥预防作用。