在畜牧养殖业,用于预防和治疗细菌感染疾病的传统抗生素存在诸多弊端,研制新型安全的抗生素替代品已成当务之急。猪源抗菌肽PR39是最早从猪体内分离得到的抗菌肽,在体外实验中具有较强的杀菌活性,并具有趋化、促进损伤修复等多种免疫调节功能。前期研究表明,细菌感染时猪体内抗菌肽PR39的表达显著升高,提示PR39在猪的抗感染过程中可能发挥重要作用,但其具体发挥何种作用以及其作用机制还不得而知。因此,本研究从抗菌肽PR39调节动物肠道黏膜上皮屏障功能的角度出发,开展了三个试验：首先利用人工模拟猪胃肠液和血清研究了抗菌肽PR39在猪体内的抗菌活性和稳定性,并通过小鼠活体成像技术探究PR39经腹腔注射后的分布与代谢情况；在此基础上进一步利用感染机制不同的两种常见致病菌感染的小鼠模型,系统地研究了抗菌肽PR39对细菌感染引起的肠道上皮屏障功能破坏的保护作用；最后利用Transwell培养的猪肠道上皮细胞模型,初步探究了抗菌肽PR39调节肠道黏膜上皮屏障功能的分子机制。主要研究结果如下：试验一抗菌肽PR39在体内的抗菌活性、稳定性及分布研究为了探明抗菌肽PR39在体内是否具有抗菌活性,首先利用人工胃液、小肠液和血清模拟体内环境,研究了其在体内的抗菌活性和稳定性。抗菌活性结果表明,在MH肉汤培养基中抗菌活性较强的PR39,在人工胃液和小肠液环境下其抗菌活性完全丧失,而在血清中保留了一部分抗菌活性。稳定性试验结果表明,PR39与人工小肠液共同孵育5min即被快速降解为小肽,与人工胃液共同孵育1h内也逐渐被降解完全,提示PR39在胃肠道环境下稳定性极差,不宜直接口服。而PR39与血清共同孵育1h后,依然可检测到约70%完整的PR39,其半衰期约为2 h,提示PR39在血清里具有较好的稳定性,宜通过注射给药。进一步通过小鼠活体成像技术,观察抗菌肽PR39经腹腔注射后在体内的分布代谢情况,结果表明,PR39经腹腔注射后可迅速被腹膜吸收而进入机体循环系统,30 min内遍布全身,并在24h内完全代谢出体外,提示抗菌肽PR39经腹腔注射途径可以进入机体循环系统而发挥作用。试验二抗菌肽PR39对小鼠抗细菌感染的作用研究(1)抗菌肽PR39对小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌感染的作用研究通过建立鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠模型,从表观症状、炎症反应及肠道黏膜上皮屏障功能三个方面研究了PR39对小鼠抗沙门氏菌感染的作用：抗菌肽PR39对沙门氏菌感染小鼠表观症状影响的结果表明,小鼠在感染鼠伤寒沙门氏菌后,出现食欲下降、体重下降及软便等症状,而腹腔注射PR39可以明显缓解上述症状,且小鼠肾脏和肝脏中细菌移位数量也显著降低,说明腹腔注射PR39显著缓解了小鼠的沙门氏菌感染症状；抗菌肽PR39对沙门氏曹感染小鼠炎症反应影响的结果表明,腹腔注射PR39的沙门氏菌感染小鼠其结肠组织的MPO浓度显著低于沙门氏菌组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05),表明PR39在一定程度上减少了沙门氏菌感染引起的小鼠结肠嗜中性粒细胞浸润。但血清里炎性细胞因子含量及结肠中炎性细胞因子基因表达水平结果显示,沙门氏菌组小鼠和腹腔注射PR39的沙门氏菌感染小鼠的促炎因子TNF-a、IL-8和抑炎因子IL-10的表达水平并无显著差异,均显著高于正常对照组(P<0.05),提示PR39对炎性细胞因子的表达与分泌并无显著影响；抗菌肽PR39对沙门氏菌感染小鼠肠道黏膜上皮屏障功能影响的结果表明,PR39显著缓解了沙门氏菌感染造成的小鼠回肠绒毛高度变短、隐窝加深及绒毛／隐窝比下降,同时也显著改善了结肠形态。利用尤斯灌流室测定结肠跨上皮电阻值(TER)和测定灌胃后血清中FITC-dextran含量两种方法来评价各组小鼠的肠道通透性,结果表明,腹腔注射PR39可以显著缓解沙门氏菌引起的小鼠肠道通透性升高,且单独添加PR39可能增强了小鼠的肠道屏障功能。(2)抗菌肽PR39对小鼠抗肠出血性大肠杆菌感染的作用研究本试验进一步通过建立与鼠伤寒沙门氏菌作用机制完全不同的肠出血性大肠杆菌感染的小鼠模型,从表观症状、肾脏及肠道组织形态和肠道黏膜上皮屏障功能三个方面研究了抗菌肽PR39对小鼠抗大肠杆菌感染的作用：抗菌肽PR39对大肠杆菌感染小鼠表观症状影响的结果表明,小鼠在感染肠出血性大肠杆菌后,体重显著下降,结肠组织MPO含量急剧升高,而腹腔注射PR39显著缓解了上述症状,肾脏和肝脏中移位的细菌数量及概率也明显降低；抗曹肽PR39对大肠杆菌感染小鼠肾脏及肠道组织形态影响的结果表明,PR39显著缓解了肠出血性大肠杆菌感染导致的小鼠肾脏肾间质血管和肾小球毛细血管充血、扩张等肾脏损伤,并且对小鼠回肠绒毛受损、黏膜下层充血,及结肠固有层水肿等形态破坏具有一定的改善作用。透射电镜结果显示,大肠杆菌感染后小鼠结肠上皮细胞遭到大肠杆菌的粘附与破坏,其微绒毛明显扭曲、变短和断裂,上皮细胞间紧密连接打开,而腹腔注射PR39的大肠杆菌感染小鼠结肠上皮细胞微绒毛排列整齐,形态正常,上皮细胞间紧密连接清晰。上述结果显示PR39对大肠杆菌感染导致的肾脏及肠道组织形态受损具有一定的保护作用；抗菌肽PR39对大肠杆菌感染小鼠肠道黏膜上皮屏障功能影响的结果表明,相比于大肠杆菌组,腹腔注射PR39后小鼠结肠TER值显著升高(P<0.05),血清中FITC-dextran含量显著降低(P<0.05),表明腹腔注射PR39可以显著缓解肠出血性大肠杆菌引起的肠道通透性升高。此外,PR39显著缓解了大肠杆菌感染引起的小鼠结肠ZO-1和Occludin的基因表达水平下降,且PR39单独处理组小鼠结肠Occludin的基因表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)。各处理组之间ZO-2和Claudin-1的基因表达水平差异不明显。试验三抗菌肽PR39调控肠道屏障功能的作用机制研究(1)抗菌肽PR39对细菌感染猪肠道上皮细胞屏障功能的影响在上述结果的基础上,进一步利用体外猪肠道上皮细胞(IPEC-1)细菌感染模型研究PR39对细菌感染后上皮细胞的紧密连接蛋白Occludin和细胞骨架蛋白F-actin的表达与分布、粘附与入侵细胞的细菌数量及上皮细胞通透性的影响。首先,不同浓度PR39作用于IPEC-1细胞后细胞的增值率和LDH释放率的结果表明,PR39对IPEC-1细胞的毒性较小。免疫荧光试验观察各组上皮细胞的Occludin和F-actin的表达与分布结果表明,沙门氏菌或大肠杆菌分别刺激IPEC-1细胞4h后,细胞Occludin荧光值减弱并从细胞膜往细胞质分布,F-actin排列紊乱,出现应力纤维,而2 μg/mL PR39预处理明显改善了沙门氏菌和大肠杆菌感染引起的猪肠道上皮细胞紧密连接蛋白Occludin的表达下降和分布异常以及细胞骨架的重排。利用Transwell培养IPEC-1细胞细曹感染模型研究PR39对细菌粘附与入侵,以及细胞通透性的影响发现,两种试验设计(2μg/mL PR39预处理IPEC-1细胞后不洗去直接进行细菌感染,或洗去后再进行细菌感染)均能显著减少沙门氏菌的入侵数和大肠杆菌的粘附数(P<0.05),且体外抑菌试验结果显示PR39浓度为2 μg/mL时对沙门氏菌和大肠杆菌都没有抗菌活性。测定各组细胞TER值发现,PR39能显著缓解细菌感染导致的IPEC-1细胞通透性升高(P<0.05)。以上结果提示抗菌肽PR39可能通过增强肠道上皮细胞屏障功能发挥了抗细菌粘附与入侵的作用,而不是通过其抗菌作用实现的。(2)单独添加抗菌肽PR39对猪肠道上皮细胞屏障功能的影响利用研究紧密连接蛋白组装的经典方法Calcium Switch,进一步研究单独添加PR39对上皮细胞通透性及紧密连接蛋白Occludin表达的影响。结果表明,在细胞培养基中缺钙再恢复钙离子后,2μg/mL及以上浓度PR39处理组的TER值恢复速度显著快于对照组,而且0.5μg/mL以上浓度处理组均能提高IPEC-1细胞Occludin蛋白的表达。上述结果表明抗菌肽PR39可促进紧密连接蛋白Occludin的表达,调节肠道上皮细胞的通透性。(3)基因芯片分析抗菌肽PR39对猪肠道上皮细胞基因表达的影响利用基因芯片技术筛选PR39处理后猪肠道上皮细胞IPCE-1的差异表达基因,结果表明,基因表达差异达2倍以上的基因共有138个,其中表达上调的基因有134个,下调的基因为3个。通过MAS 3.0分析得出这些差异表达基因涉及的通路包括Tight junction. Regulation of actin cytoskeleton 和 Pathogenic Escherichia coli infection-EHEC等与本研究密切相关的信号通路,这些通路多涉及Rho小G蛋白家族(Rho GTPase)、WASL、PRKAA1及MAP3K5等基因,其中与Rho GTPase家族成员相关的通路最多。(4)抗菌肽PR39调控猪肠道上皮细胞紧密连接蛋白的分子机制研究由于基因芯片结果的启发,从FRho GTPase家族入手,进一步研究PR39调节肠道上皮细胞屏障功能的分子机制。G-LISA法测定细胞中RhoA,Racl和Cdc42的活化水平试验结果表明,抗菌肽PR39处理细胞5 min和24 h后,IPEC-1细胞Rac1的活化量较正常对照组显著升高(P<0.05),而RhoA与Cdc42均无显著变化。利用Rac1的专一抑制剂NSC 23766研究抑制Racl的活化后对PR39作用的影响,结果表明,抑制Rac1的活化后,PR39对猪肠道上皮细胞通透性的改善作用及对Occludin表达量的提升作用均受到抑制。而且,PR39对沙门氏菌入侵和大肠杆菌粘附的减少作用也被部分抑制。上述结果表明抗菌肽PR39通过促进Rho GTPase家族成员Racl的活化调控肠道上皮细胞屏障功能。上述研究一方面为通过营养手段调控猪内源抗菌肽的表达而提高仔猪的抗病力,减少甚至替代抗生素的使用提供了新的思路和理论依据,另一方面为将抗菌肽开发为治疗人类及畜禽细菌感染的药物提供了新的候选肽,具有重要的指导意义。