【摘 要】
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黄酮类化合物在植物中广泛分布,对植物的生长发育和抵抗非生物胁迫具有重要作用,而且具有多种药理活性。在黄酮类化合物生物合成途径中,黄酮合酶Ⅰ（Flavone synthase Ⅰ,FNS Ⅰ）催化黄烷酮生成黄酮,黄烷酮-3-羟化酶（Flavanone 3β-hydroxylase,F3H）催化黄烷酮C3位羟基化,生成的二氢黄酮醇作为底物参与黄酮醇和花色素的合成。FNS I和F3H均属于2-酮戊二酸/
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黄酮类化合物在植物中广泛分布,对植物的生长发育和抵抗非生物胁迫具有重要作用,而且具有多种药理活性。在黄酮类化合物生物合成途径中,黄酮合酶Ⅰ（Flavone synthase Ⅰ,FNS Ⅰ）催化黄烷酮生成黄酮,黄烷酮-3-羟化酶（Flavanone 3β-hydroxylase,F3H）催化黄烷酮C3位羟基化,生成的二氢黄酮醇作为底物参与黄酮醇和花色素的合成。FNS I和F3H均属于2-酮戊二酸/铁（Ⅱ）依赖性双加氧酶,F3H主要在被子植物中鉴定,课题组前期研究表明苔类植物单功能酶FNS Ⅰ和双功能酶黄酮合酶Ⅰ/黄烷酮-2-羟化酶（Flavone synthase Ⅰ/Flavanone 2-hydroxylase,FNS Ⅰ/F2H）共存,藓类植物 FNS I有较弱F3H功能,裸子植物F3H有较弱FNS I功能,推测被子植物F3H由苔类植物FNS Ⅰ经双功能酶过渡类型进化而来。蕨类植物作为苔藓植物向种子植物进化的重要中间类型,其黄酮醇和花色素的存在比苔藓植物更加普遍,但目前尚无FNS Ⅰ和F3H相关报道。因此从蕨类植物中挖掘出FNS Ⅰ和F3H基因,有助于分析蕨类植物中FNS Ⅰ和F3H的特点,进一步阐明植物FNS Ⅰ和F3H功能演化关系及意义。松叶蕨（Psilotum nudum）作为我国仅有的松叶蕨属植物,属于蕨类植物中较为原始的类群,富含黄酮类化合物。本课题通过分析松叶蕨转录组数据,根据基因功能注释,从中找到1个注释为flavanone 3 β-hydroxylase的候选基因,并命名为Pn2ODD。进化树分析表明,Pn2ODD位于裸子植物F3H和被子植物F3H的基部。序列比对发现,Pn2ODD序列与银杏（Ginkgo biloba）的F3H序列相似度较高。前期研究发现的决定苔类植物FNS Ⅰ和种子植物F3H功能相关的关键氨基酸残基在Pn2ODD序列中与种子植物F3H相同,与苔类植物FNS Ⅰ不同。将Pn2ODD构建到原核表达载体,经过重组蛋白纯化和酶活分析,结果表明Pn2ODD能以柚皮素为底物,催化生成芹菜素和二氢山奈酚,表现出FNS Ⅰ/F3H双功能活性。因此,根据其活性重新将其命名为PnFNS Ⅰ/F3H。同时,底物选择性分析表明PnFNS I/F3H具有较为广泛的底物催化活性,能够催化常见的黄烷酮类化合物。以拟南芥AtANS作为模板,通过同源模拟分析和定点突变,将PnFNS Ⅰ/F3H的脯氨酸Pro突变为酪氨酸Tyr得到突变蛋白PnFNS Ⅰ/F3H-P228Y,以柚皮素为底物进行酶活分析,结果表明PnFNS Ⅰ/F3H-P228Y催化柚皮素生成2-羟基柚皮素和芹菜素。PnFNS Ⅰ/F3H-P228Y由FNS Ⅰ/F3H功能变成FNS Ⅰ/F2H功能,进一步表明苔类植物FNS I/F2H与FNS Ⅰ/F3H之间可能具有演化关系。为了研究PnFNS Ⅰ/F3H在植物体内的功能,我们将PnFNS Ⅰ/F3H分别转入拟南芥（Arabidopsis thaliana）tt6（f3h）突变体和dmr6（fNS Ⅰ）突变体中。利用HPLC-MS和代谢组学分析手段分析PnFNS Ⅰ/F3H-tt6和PnFNS Ⅰ/F3H-dmr6过表达植株中黄酮类化合物的变化,结果表明PnFNS Ⅰ/F3H-tt6转基因植物体内黄酮,黄酮醇和花青素的含量均增加,且黄酮增加得最为明显。PnFNS Ⅰ/F3H-dmr6转基因植株体内黄酮类化合物芹菜素和黄酮醇类化合物槲皮素也有所增加,且芹菜素增加得更加明显。以上结果表明PnFNS I/F3H在拟南芥体内能够发挥以FNS Ⅰ为主的FNS Ⅰ/F3H双功能。本课题首次从蕨类植物松叶蕨中鉴定出一个20DD基因,其具有FNS Ⅰ/F3H双功能活性。通过定点突变,PnFNS Ⅰ/F3H-P228Y实现由FNS Ⅰ/F3H向FNS Ⅰ/F2H功能的转变,并且PnFNS Ⅰ/F3H分别在两种突变体拟南芥中过表达可以提高黄酮类化合物的含量,表现出FNS Ⅰ/F3H双功能。PnFNS Ⅰ/F3H-P228Y的功能转变进一步表明被子植物F3H与苔类植物FNS Ⅰ之间的功能演化关系,PnFNS Ⅰ/F3H的发现为黄酮类化合物的生物合成提供了候选基因。
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