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目的探讨脊髓趋化因子CX3CL1/CX3CR1在吗啡耐受形成中的作用材料与方法1.SPF级雄性SD大鼠42只,运用随机数字表编号分为3组:空白组(Na?ve组),生理盐水组(Sham组)和吗啡耐受组(MT组),每组14只。Na?ve组动物不做任何处理,生理盐水组和吗啡耐受组动物行鞘内置管术。大鼠术后休息7天后测量大鼠痛阈作为基础痛阈。术后第8天,Sham组和MT组大鼠分别鞘内给予5μL生理盐水和5μL吗啡(2μg/μL),并应用10μL生理盐水冲管,每天两次(8:00 am和5:00 pm),连续给药7天。分别于给药第1、3、5、7天测量大鼠水浴热痛甩尾反应时间,计算最大镇痛效能(Maximal Possible Antinociceptive Effect,%MPE)。于给药第7天,测痛结束后取大鼠脊髓腰膨大组织,应用蛋白质印记法(Western blot,WB)检测脊髓背角Iba-1(Ionized calcium-binding adapter molecule 1)的表达变化。应用荧光实时定量PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和WB检测各组大鼠脊髓背角μ阿片受体(MOR),趋化因子CX3CL1和受体CX3CR1的表达变化。2.SPF级雄性SD大鼠42只,随机分为7组:Sham组,MT组,IgG+MT组,rrCX3CL1(100 ng)+MT组,rrCX3CL1(500 ng)+MT组,anti-CX3CR1(5μg)+MT组和anti-CX3CR1(10μg)+MT组,每组6只。所有大鼠测量基础痛阈后行鞘内置管术。rrCX3CL1(100 ng)+MT组和rrCX3CL1(500 ng)+MT组大鼠分别给予100 ng和500ng重组大鼠CX3CL1蛋白,30分钟后给予10μg(2μg/μL)吗啡;anti-CX3CR1(5μg)+MT组和anti-CX3CR1(10μg)+MT组大鼠分别鞘内注射5μg和10μg anti-CX3CR1中和抗体30分钟后给予10μg(2μg/μL)吗啡;IgG+MT组大鼠鞘内注射10μg(2μg/μL)IgG作为溶剂对照,30分钟后鞘内注射10μg(2μg/μL)吗啡。动物连续鞘内给药7天,每天两次(8:00 am和5:00 pm),分别于给药第1、3、5、7天上午鞘内注射吗啡后30分钟应用热水浴甩尾试验测定计算大鼠%MPE,观察预先给予外源性重组趋化因子CX3CL1蛋白和CX3CR1中和抗体对吗啡耐受形成的行为学影响。于吗啡给药第7天测痛后取大鼠腰膨大组织,采用WB法检测各组样本中小胶质细胞活化程度。3.SPF级雄性SD大鼠6只,鞘内置管后恢复7天,随机分为两组:Sham组和MT组。术后第8天开始鞘内注射药物,一天两次,连续给药7天。每次于早上给药后30分钟测痛,给药第7天测痛后所有大鼠用4%多聚甲醛心脏灌注固定,取固定后的L1-L5段脊髓组织制备冰冻切片,采用免疫荧光法检测脊髓背角CX3CL1及CX3CR1的表达变化,荧光双标法定位表达CX3CL1及CX3CR1的神经细胞。结果1.与Na?ve组大鼠相比,Sham组大鼠在给药后第1,3,5,7天%MPE均无明显差异,表明鞘内置管操作不会影响大鼠对疼痛刺激的反应性;与Sham组相比,MT组在给药第1天(P<0.001)和第3天(P<0.01)痛阈明显升高,说明吗啡成功注射入大鼠鞘内并发挥镇痛效应;从第5天开始持续到第7天发现同等剂量吗啡的镇痛效能明显下降,与Sham组相比没有统计学差异(P>0.05),表明吗啡耐受状态形成。WB结果显示,与Na?ve组相比,Sham组小胶质细胞Iba-1表达量无变化,而吗啡组Iba-1表达量明显升高(P<0.05),说明小胶质细胞的活化参与了吗啡耐受的形成。qRT-PCR和WB结果显示,与Na?ve组和Sham组相比,MT组大鼠脊髓MOR的mRNA和蛋白表达量都没有发生改变(P>0.05);与Sham组相比,吗啡耐受组趋化因子CX3CL1和CX3CR1在转录和翻译水平的表达量亦没有观察到明显变化(P>0.05),表明CX3CL1及其受体CX3CR1可能不通过改变自身表达量参与吗啡耐受的形成。2.与术前相比,大鼠行鞘内置管术后基础痛阈无明显变化(P>0.05)。与Sham组相比,所有给予吗啡的大鼠在第1天均出现痛阈升高的表现,第3天镇痛效果则明显下降,但仍高于基础值(P<0.05),至第5天和第7天时,出现稳定的吗啡耐受现象。rrCX3CL1(100 ng)+MT组与IgG+MT组相比从第1天至第7天痛阈未见显著差异,增大rrCX3CL1剂量至500 ng,痛阈仍未见明显变化,表明外源性重组大鼠趋化因子CX3CL1在脊髓水平不显著影响吗啡耐受的发生过程。同样,与IgG+MT组相比,anti-CX3CR1(5μg)+MT组和anti-CX3CR1(10μg)+MT组大鼠的痛阈从第1天至第7天均未出现明显变化(P>0.05),表明当应用anti-CX3CR1中和抗体阻断CX3CR1时,并不会影响大鼠在长期吗啡作用下产生药物的耐受现象。Western blot检测结果显示,与IgG+MT组相比,Iba-1表达水平在rrCX3CL1(100 ng)+MT组,rrCX3CL1(500 ng)+MT组,anti-CX3CR1(5μg)+MT组以及anti-CX3CR1(10μg)+MT组间均未见统计学差异(P>0.05)。3.免疫荧光相对定量检测结果显示,与Sham组相比,MT组大鼠脊髓CX3CL1与CX3CR1的表达无统计学差异(P>0.05)。免疫荧光双标结果可见,Sham组大鼠脊髓中CX3CL1与神经元标记物NeuN共表达,CX3CR1与小胶质细胞标记物Iba-1共表达。MT组大鼠脊髓切片中可见小胶质细胞胞体变大,突起短粗,呈活化状态;CX3CL1不仅与NeuN共表达,还与星形胶质细胞标记物GFAP和Iba-1共表达;CX3CR1也同时与NeuN、GFAP以及Iba-1共表达,表明在吗啡耐受的形成过程中,CX3CL1以及CX3CR1神经细胞表达位置发生改变,可能与吗啡耐受的形成有关。研究总结1.吗啡耐受大鼠脊髓小胶质细胞活化明显增加,μ阿片受体的表达未见明显改变。2.吗啡耐受大鼠脊髓CX3CL1及其受体CX3CR1的表达量未见显著改变。3.外源性CX3CL1重组蛋白或CX3CR1中和抗体既不影响大鼠吗啡耐受形成过程中痛阈水平,也不改变吗啡诱导的小胶质细胞活化程度。4.吗啡耐受状态下,CX3CL1与CX3CR1分别表达于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。结论脊髓CX3CL1及其受体CX3CR1不通过自身表达量的改变参与吗啡耐受的形成,推测其作用可能与改变神经元与胶质细胞之间的信号传递方式有关。