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水稻是最为重要的粮食作物之一,而二化螟是最为常见的一种水稻害虫,每年都会造成巨大的经济损失。目前水稻生产上二化螟的防治主要依赖化学杀虫剂,然而由此产生的环境污染、生态破坏、食品安全以及害虫耐药性等问题较为突出。因此,培育抗二化螟水稻品种来代替化学杀虫剂防治方法尤为重要。随着RNA干扰(RNAi)技术的不断地发展与成熟,其中人工micro RNA(artificial micro RNA,amiRNA)技术的高效率、精准作用靶点等优点,被认为是一种极具潜力的控制农作物害虫的新策略。在前期工作中,我们利用已鉴定的二化螟内源micro RNA序列csu-miR260构建amiRNA表达载体并转化水稻,获得了两个纯合的单拷贝插入的转基因水稻家系csu260-16-4和csu260-18-2。室内喂饲表明,这两个转基因水稻家系对二化螟幼虫有较好的抗性。在前期研究的基础上,本研究进一步获得了以下主要研究结果。1.运用高通量小RNA测序技术对转基因水稻csu260-16-4和csu260-18-2进行测序,结果表明与转入的amiRNA表达载体所匹配的小RNA长度集中在20～21nt,符合天然miRNA在植物体内的积累特征。我们体外合成了csu260-16-4和csu260-18-2体内含量最高的20 nt和21 nt amiRNA序列的模拟物(agomir)进行体外二化螟饲喂实验,发现饲喂5 d后实验组agomir-20和agomir-21二化螟幼虫的死亡率显著高于取食对照组agomir-NC,且残虫生长缓慢、虫重降低。与此同时,取食csu-260 agomir残虫体内对应的csu260小RNA显著升高,而与之对应的靶标基因Dib的表达量明显降低。2.我们利用csu260-16-4和csu260-18-2转基因水稻开展了二化螟幼虫连续35 d茎秆饲喂实验。连续饲喂过程中,取食csu260两个家系的二化螟死亡率持续上升。第5 d取食csu260水稻茎秆的二化螟幼虫的体重显著低于取食对照茎秆的幼虫。但是,第10 d取食csu260水稻茎秆的二化螟幼虫的体重与取食对照茎秆幼虫的体重没有明显差异。因此,我们认为csu260水稻茎秆对取食的二化螟幼虫具有筛选作用,二化螟幼虫在取食csu260水稻茎秆后死亡率上升,而存活下来二化螟幼虫能适应csu260水稻的茎秆,所以其体重随着时间的推移而逐渐接近对照幼虫。3.为了评价csu260-16-4和csu260-18-2在自然条件下的抗性,我们对这两个转基因家系进行了2次田间抗虫性试验。第一次,在水稻分蘖期对每个单株水稻接30头二龄二化螟幼虫,35 d后对水稻枯心的统计结果显示,csu260-16-4和csu260-18-2相对与受体亲本ZH11而言枯心率分别降低了62.89%和50.38%;第二次于水稻抽穗期接种400头性别随机的二化螟蛾子,40 d后统计水稻白穗率,csu260-16-4和csu260-18-2相对于受体亲本ZH11对照,白穗率分别降低了74.00%和54.00%。田间试验证实了两个csu260家系在大田条件下仍具有较高的抗虫性。4.我们根据csu-miR260对应的靶基因Dib设计了相应的双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)干涉载体转化水稻。选取了表达量高的三个dsRNA转基因水稻与csu260-16-4和csu260-18-2转基因水稻进行抗虫性对比实验。用生长状态良好的水稻茎秆饲喂二化螟初孵幼虫7 d后,发现csu260两家系的平均死亡率和平均虫重均低于饲喂dsDib水稻茎秆的幼虫。上述结果证明amiRNA介导的RNAi比dsRNA介导的RNAi具有更好的抗虫潜力。我们的实验结果证明利用二化螟内源miRNA介导的RNAi策略在抗虫实际应用中有巨大的潜力,为发展新型害虫防治策略、培育抗二化螟转基因水稻和揭示amiRNA抗虫机制奠定了坚实的基础。