人视网膜色素上皮细胞中slit2基因对RF/6A细胞迁移及管腔形成的影响

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目的:在共培养模型下,观察人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells, RPE)中slit2基因对脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)迁移及管腔形成的影响。方法:1.将腺病毒介导的slit2 (Ad-slit2)及空腺病毒载体(Ad-null)转染RPE细胞24h、48h。通过逆转录PCR (Reverse transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及Western-blot检测转染后的RPE细胞中slit2的表达水平。2.建立RPE & RF/6A共培养模型,采用Transwell小室法及Matrigel胶体外三维成型法分别检测过表达slit2基因的RPE细胞对RF/6A细胞迁移能力及管腔形成能力的影响,并计算迁移数目及形成完整管腔个数。3.在缺氧条件下,shRNA-slit2转染RPE细胞后,利用RT-PCR及Western-blot检测slit2的表达变化。4.建立共培养体系,通过Transwell小室法检测缺氧条件下,抑制RPE细胞中的slit2基因对RF/6A细胞迁移能力的影响并计算迁移数目;采用Matrigel胶体外三维成型法检测缺氧条件下,抑制RPE细胞中的slit2基因对RF/6A细胞管腔形成能力的影响及测量形成完整管腔的个数。5. RT-PC、Western-blot及ELISA检测缺氧条件下抑制RPE细胞中的slit2后VEGF的表达变化。结果:1. Ad-slit2转染24h、48h后,RPE细胞中slit2mRNA和蛋白表达水平较空白对照组均明显增高。2.在RPE&RF/6A共培养下,空白对照组、Ad-null转染24h组、Ad-slit2转染24h组、Ad-null转染48h组、Ad-slit2转染48h组中,RF/6A细胞迁移数目分别是(40.6±4.5)、(36.7±3.5)、(67.7±4.2)、(36.0±3.6)、(79.7±3.5);形成完整管腔个数分别是(8.7±3.2)、(8.9±3.6)、(15.9±4.2)、(8.3±2.4)、(23.3±4.5)。Ad-slit2转染24h及48h组与空白对照组比较,差异均具有统学意义(P<0.05)。3.在缺氧条件下,经shRNA-slit2转染后,RPE细胞中的slit2mRNA和蛋白表达降低。4.共培养体系中,空白对照组、缺氧组、缺氧下空腺病毒组、缺氧下shRNA-slit2组中,RF/6A细胞迁移数目分别是(36.7±5.5)、(110.0±8.0)、(104.6±14.6)、(61.0±5.3);形成完整管腔个数分别是(6.7±1.5)、(19.7±3.5)、(21.3±3.8)、(10.3±1.6)。缺氧下shRNA-slit2组与缺氧组比较,缺氧组与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5. RT-PCR、Western-blot及ELISA结果显示在缺氧条件下转染shRNA-slit2可使RPE细胞中的VEGF表达降低。结论:1.人RPE细胞中slit2基因可促进RF/6A细胞迁移及管腔形成。2.缺氧条件下,降低RPE细胞中slit2基因的表达可抑制RF/6A细胞迁移及管腔形成。3.RPE细胞中slit2基因可能参与CNV的形成,为CNV的治疗方法提供新的领域。
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