灰飞虱Laodelphax striatellus（Fallén）是我国重要的禾谷类害虫。施用化学药剂是防治灰飞虱的主要措施,随着杀虫剂的大量施用,灰飞虱对吡虫啉和毒死蜱等多种常用杀虫剂产生了抗药性。研究表明,细胞色素P450酶活性的增强是灰飞虱对吡虫啉产生抗性的主要原因。实验室前期已证实,抗吡虫啉灰飞虱Imid品系中过量表达的CYP6AY3v2和CYP353D1v2对吡虫啉具有代谢作用。由于细胞色素P450酶具有进化的可塑性,所以,灰飞虱中可能还有其他的P450酶对吡虫啉具有代谢作用。为了鉴定这些潜在的P450酶,本研究前期利用转基因技术,从63个灰飞虱P450基因中筛选到CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10这三个可能对吡虫啉具有代谢作用的P450酶。为了验证筛选结果,本研究对CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10三个P450酶进行了体外表达、酶活力测定和对吡虫啉的体外代谢研究,研究结果总结如下:1.3个灰飞虱重组P450酶的体外表达利用昆虫杆状病毒表达系统,对灰飞虱P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10以及细胞色素P450还原酶（CPR）进行了体外重组表达。利用空斑分析法测得空载FastBac-HTA、CPR以及三个灰飞虱重组P450酶的P3代病毒滴度分别为 7.0×107（pfu/mL）、6.0×107（pfu/mL）、4.0×107（pfu/mL）和 5.0×107（pfu/mL）。将三个重组P450酶的P3代病毒液分别与CPR按MOI（病毒感染复数）值分别为2和0.2加入High Five细胞悬液中,进行体外表达。利用CO差光谱法分别测定了重组CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10的蛋白含量及光谱特征。结果显示,这三个重组P450酶与CO结合后在450 nm处都有明显的吸收峰,表明三个重组P450蛋白性质稳定并具备P450蛋白的特征;其次,CYP6CW1、CYP6FK1 和 CYP380C10 的蛋白含量分别为 284.25±4.12 pmol/mg protein、138.42±4.64 pmol/mg protein 和 311.09±1.89 pmol/mg protein。2.3个灰飞虱重组P450酶对四种模式底物代谢活性的测定分别测定了灰飞虱三个重组P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10蛋白对对硝基苯甲醚（PNA）、7-乙氧基香豆素（EC）、7-苄基-4-三氟甲基香豆素（BFC）和7-甲基试卤灵（MR）四种模式底物的代谢活性。结果显示:与对照组相比,CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10均对EC有较高的氧脱乙基活性,比活力值在2.16～3.56之间;CYP6CW1和CYP6FK1对PNA显示出了较高的氧脱甲基活性,比活力值分别是3.36和2.59;在以MR为底物时,仅CYP6CW1显示出了氧脱甲基活性,活性比值为2.23;三个重组P450酶对BFC都没有氧脱苄基活性;上述结果表明三个重组表达的P450酶对不同的底物显示不同的活性。3.3个灰飞虱重组P450酶对吡虫啉的体外代谢研究将重组P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10分别与吡虫啉进行孵育,以未加入NADPH再生系统的样品和空载HTA加上NADPH为阴性对照,通过超高效液相-串联四级杆飞行时间质谱UPLC-QTOF MS检测代谢产物5’-羟基吡虫啉的生成量,并以5’-羟基吡虫啉的生成速率表征重组P450酶对吡虫啉的代谢活性。结果显示:重组表达的CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10生成5’-羟基吡虫啉的速率分别是 0.0198±0.0008 pmol 产物/min/pmol P450,0.0172±0.0005 pmol 产物/min/pmol P450 和 0.0055±0.0001 pmol 产物/min/pmol P450。进一步的酶动力学研究结果显示:重组表达的CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10代谢吡虫啉时,代谢产物5’-羟基吡虫啉的生成具有时间依赖性;并且测得了CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10的动力学参数Km值分别为79.86±6.5 μM、58.69±2.6 μM和67.15±3.2 μM,进一步得到P450酶代谢吡虫啉的内在清除率（Vmax/Km）分别为 0.00025、0.00029 和 0.00008。综上所述,本文研究结果证实了灰飞虱重组P450酶CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10对吡虫啉代谢的作用,为灰飞虱CYP6CW1、CYP6FK1和CYP380c10可能参与吡虫啉代谢抗性的形成提供了证据。