【摘 要】
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花青素属于类黄酮次生代谢物,影响植物组织器官的颜色,也与种子含油量及油菜抗逆性有关。ANS基因是花青素生物合成途径的关键酶基因之一。本研究对油菜BnANS-2（BnaA01g12530D）基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达分析,对其编码产物进行亚细胞定位分析;构建了该基因的过表达载体并转化甘蓝型油菜,获得了转基因植株,并进行了表型分析。主要研究结果如下:1.基因克隆（1）本研究从甘蓝型油菜中双
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花青素属于类黄酮次生代谢物,影响植物组织器官的颜色,也与种子含油量及油菜抗逆性有关。ANS基因是花青素生物合成途径的关键酶基因之一。本研究对油菜BnANS-2（BnaA01g12530D）基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达分析,对其编码产物进行亚细胞定位分析;构建了该基因的过表达载体并转化甘蓝型油菜,获得了转基因植株,并进行了表型分析。主要研究结果如下:1.基因克隆（1）本研究从甘蓝型油菜中双11号中克隆了花青素生物合成途径中的关键酶基因BnaA01g12530D（BnANS-2）基因,克隆得到的序列ORF大小为1077bp,编码358个氨基酸,蛋白分子量约为40861.99 Da,理论等电点为5.14。（2）油菜基因组中,ANS基因有5个同源基因,分别命名为BnANS-1、BnANS-2、BnANS-3、BnANS-4和BnANS-5。这些BnANSs基因编码的蛋白质均为酸性蛋白、亲水性蛋白,均含有DIOXN和20G-FeⅡOxy两个结构域,其二级和三级结构与拟南芥ANS蛋白结构相似。本研究选取了BnANS-2基因,开展基因功能及其应用研究。（3）BnANS-2基因启动子序列分析表明,该基因启动子含有光响应、低温响应、防御和应激反应的顺式作用元件。2.亚细胞定位分析和基因组织表达分析。（1）构建了BnANS-2基因与GFP基因的融合表达载体Bin-35S::BnANS-GFP4p,转入农杆菌GV3101,利用烟草瞬时表达进行了亚细胞定位分析,结果表明BnANS-2基因编码产物定位于细胞质中。（2）利用半定量RT-PCR分析BnANS-2基因组织表达特性。结果表明,BnANS-2基因在甘蓝型油菜叶、茎和角果中表达量较高,在根和花瓣中表达量较低。3.过表达转基因功能验证。（1）构建了BnANS-2基因的过表达载体pC3301::BnANS-2,通过农杆菌介导转化了甘蓝型油菜ZS11,筛选获得T1代转基因阳性植株4株。（2）转基因植株与对照ZS11植株有表型差异,转基因植株的叶脉、叶柄、茎和叶片边缘呈现紫色。（3）转基因植株种子的平均含油量低于对照ZS11植株种子的含油量。
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