粘虫Mythimna separata(Walker)隶属鳞翅目夜蛾科,是一种典型的季节性远距离迁飞害虫,也是严重威胁我国粮食作物生产安全的重大害虫,广泛分布于亚洲和澳洲的多个国家和地区。粘虫在我国每年南北往返迁飞危害。近年来,由于农田生态系统变化,粘虫的发生危害呈现加重趋势,尤其是2012和2013年在全国范围暴发成灾,对农业生产造成了严重的影响。生物钟基因是调控生物节律的一类基因,在细胞、组织、器官和行为等各层次中起作用。而粘虫作为一种昼伏夜出性害虫,其飞行、交配、产卵等行为均发生于夜晚,具有明显的昼夜节律。但截至目前,有关其昼夜活动节律的分子调控机制尚未见报道。本研究首次对粘虫4个生物钟基因进行了克隆,在此基础上,通过实时荧光定量PCR技术分析了相应的表达模式,并就生物钟基因对粘虫活动节律的调控进行了进一步研究。取得如下主要研究结果。1.根据粘虫转录组数据库扩增获得4种粘虫生物钟基因period、timless、clock和cycle,分别命名为Msper(KY446805)、Mstim(KY446806)、Msclk(KY446807)、Mscyc(KY825136),长度分别为3579 bp、3132 bp、1851 bp、2094 bp,分别编码1192、1043、616、697个氨基酸,预测蛋白分子量分别为132 kDa、117 kDa、69 kDa、75 kDa,理论等电点分别为6.50、5.14、5.63、6.74。经序列比对,MsPER与一点粘虫Mythimna unipuncta、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、芹菜夜蛾Anagrapha falcifera等夜蛾科昆虫PER序列一致性达83%以上;MsTIM与棉铃虫Helicoverpa armigera、甜菜夜蛾、蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides等昆虫TIM序列一致性达80%以上;MsCLK与甜菜夜蛾、棉铃虫CLK序列一致性达90%以上;MsCYC与蛀茎夜蛾,家蚕Bombyx mori、小菜蛾plutella xylostella、柞蚕Antheraea pernyi等CYC序列一致性达68%以上。进化树分析结果与氨基酸序列比对结果基本一致。2.采用实时荧光定量PCR技术分析了粘虫生物钟基因Msper、Mstim、Mscyc和Msclk的时空表达模式:(1)4个生物钟基因的mRNA在粘虫不同发育时期的表达量差异显著,成虫期表达量显著高于其他发育阶段。除Mscyc基因在1龄幼虫期表达量高于卵期外,其他基因均为幼虫期表达量最低。(2)成虫不同组织生物钟基因的表达量不同。Msper、Mstim、Mscyc在触角中表达量最高,其次为头部,而Msclk在头部的表达量显著高于触角。在飞行肌、足及生殖腺中,上述4种基因的表达量无明显的规律性。(3)4个生物钟基因的相对表达量均具有昼夜节律变化,其中Msper、Mstim与Msclk在雌、雄成虫中均表现为光期表达量较低,暗期表达量较高;而Mscyc在光期起始时表达量最高,暗期末表达量最低。3.采用显微注射法对Msper基因进行干扰,并测定其活动节律变化。结果表明干扰24 h后Msper表达量下降60%,受干扰后粘虫在夜晚无高飞行强度;而对照试虫在暗期末期出现一个高飞行强度。且受干扰的个体在沉默试剂生效的48 h内无产卵现象,试剂失效后产卵行为恢复。本研究首次克隆得到4个粘虫生物钟基因,并明确了Msper、Mstim、Mscyc和Msclk在粘虫不同发育时期、成虫不同组织中的昼夜表达规律,且证明Msper参与调控粘虫活动节律。这些结果有助于阐明生物钟基因对粘虫行为节律的调节作用,为进一步深入研究粘虫生物钟基因的调控机制奠定基础,以期为建立以昆虫行为节律为靶标的粘虫遗传防治体系,实现粘虫的可持续控制提供参考。