马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）可侵染包括茄科作物在内的160多种植物。PVY侵染马铃薯后造成产量损失可高达80%。PVY基因组全长约为9.7kb，编码一个由3062个氨基酸组成的多聚蛋白和一个通过RNA转录滑动机制形成的小蛋白P3NPIPO，多聚蛋白在自身编码的蛋白酶切割下形成11个成熟蛋白。其中辅助成分蛋白酶（Helper component proteinase，HCpro）是个多功能蛋白，参与PVY在寄主中的病毒移动和病毒传播等过程。本研究发现PVY HCpro中间区域存在保守基序WGxRE和疑似内质网定位信号ERMRS基序。本研究以PVYN605侵染性克隆为基础，对WGxRE和ERMRS基序中保守位点进行突变分析其在PVY侵染过程中的作用，鉴定了突变基序中保守氨基酸对HCpro抑制RNA沉默功能影响，结合转录组、降解组和小RNA高通量测序技术解析了短线状基序WGxRE和ERMRS在病毒病症状形成过程中的作用机制。具体结果如下：　　（1）突变HCpro WGxRE和ERMRS保守基序影响PVY致病力　　利用携带GFP的PVY侵染性克隆pCamPVYN605-GFP测定了HCpro的WGxRE和ERMRS短线状基序中9个保守位点的突变对PVY致病力的影响。结果发现，接种野生型pCamPVYN605-GFP后11天在本氏烟上能够引起系统叶片的皱缩，在紫外灯下可观察到明显的绿色荧光；接种突变体L206A、Q209A、E211A和K269RR270K的本氏烟系统叶片表现皱缩，与野生型PVY症状相似，说明这些位点的突变对PVY在本氏烟上的症状形成无明显影响；而接种突变体R261AR262AK263A到本氏烟后11天未发现系统症状，表明突变该位点导致PVY丧失侵染能力；接种突变体W207A、G208A、R210A、W207AE211A至本氏烟能够系统侵染，但是系统叶片皱缩程度降低，紫外灯下观察荧光强度较弱。突变WGxRE基序W207位点为A，或同时突变W207和E211位点为A后15天左右，与接种野生型PVY相比，引起本氏烟矮化，接种后25天矮化程度显著差异。PVY野生型病毒PVYN605及基于WGxRE的突变体都能够系统侵染马铃薯品种Shepody。虽然PVYN605能够系统侵染含有Ny抗性基因的马铃薯品种Desiree，但突变两个基序后，在马铃薯Desiree均丧失系统侵染的能力。以上结果说明，WGxRE和ERMRS基序的关键位点突变后影响了PVY的致病力，表明这两个基序在病毒的侵染中起着关键作用。　　（2）WGxRE和ERMRS保守基序参与HCpro抑制RNA沉默功能　　为分析突变WGxRE和ERMRS短线状基序中的保守氨基酸对HCpro抑制RNA沉默影响，将PVY HC-Pro构建至瞬时表达载体pCam35S，利用定点突变技术突变WGxRE和ERMRS保守基序中相应氨基酸位点。结果显示，WGxRE基序中，除了W207外，突变基序中任一位点均减弱了HCpro抑制RNA沉默能力。在抑制RNA沉默试验中，浸润后7天，浸润野生型HCpro的区域无明显绿色荧光，而浸润突变W207位点的突变体的区域仍能观察到明显绿色荧光。ERMRS基序中突变K269R270为AA或RK、突变K276K277为AA对HCpro抑制RNA沉默能力无明显影响；突变R261R262K263为AAA，HCpro丧失了抑制RNA沉默能力。以上结果表明WGxRE和ERMRS基序在HCpro抑制RNA沉默过程中具有重要作用。　　（3）WGxRE和ERMRS基序影响HCpro在寄主亚细胞内结构　　为分析WGxRE和ERMRS基序在HCpro亚细胞定位中的作用，将GFP和HCpro融合，获得GFPHCpro、GFPHCproW207A、GFPHCproE211A、GFPHCproW207AE21、GFPHCproK269RR270K和GFPHCproR261AR262AK263A。在本氏烟瞬时表达后，激光共聚焦观察发现突变WGxRE和ERMRS基序未导致HCpro亚细胞定位的明显变化。GFPHCpro及其突变体在细胞内形成的绿色荧光颗粒数量和大小有明显差异。GFPHCproW207A、GFPHCproW207AE211A、GFPHCproK269RR270K形成的颗粒数量和大小与GFPHCpro相似，GFPHCproE211A和GFPHCproK276AR277A形成的荧光颗粒明显少于野生型GFPHCpro。结合HCpro抑制RNA沉默功能变化发现细胞内产生的绿色荧光颗粒数量和大小与抑制RNA沉默能力密切相关。　　（4）解析了HCpro中WGxRE基序在病毒病症状形成过程中作用机制。　　农杆菌浸润接种W207A或W207AE211A至本氏烟均引起植株严重矮化，而突变体E211A位点未引起明显植株矮化，表明W位点在调控PVY在本氏烟上的症状中具有重要作用。在接种野生型PVYN605和W207A突变体本氏烟植株未表现明显株高差异时采集系统叶片，利用转录组高通量测序技术分析了二者基因表达变化。转录组中KEGG分析发现差异基因主要富集在调控植物激素信号转导、植物病原互作与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等途径。对植物激素信号转导途径相关基因分析发现调控植物发育的生长素相关基因发生显著变化。利用qRT-PCR对参与调控生长素的关键基因AUX/IAA、ARF、SAUR、YUCCA6和PIN1分析发现，与接种PVYN605的植株相　　比，这些基因表达水平均显著上调。接种突变体W207A后13天本氏烟中IAA积累水平是接种野生型病毒中IAA积累水平的3.2倍。　　利用小RNA测序和降解组测序进一步分析与生长素相关的microRNA及其靶基因，结果显示，接种突变体W207A的本氏烟中生长素相关的microRNA与其靶基因基因的数量显著低于野生型。以上结果表明马铃薯Y病毒HCpro可以通过调控寄主体内microRNA的积累水平来影响其靶标基因的表达水平。