精确高效的实现内源基因靶向编辑是转基因技术的难点和重点。传统的自发同源重组方法的效率低下和逆病毒载体法的安全性差等问题，限制其广泛应用和转基因新品种的培育。锌指核酸酶作为一种人工核酸酶，含有特异DNA识别结构域锌指蛋白和非特异性DNA切割活性域FokⅠ，赋予了其靶向切割特定DNA双链的能力。当锌指核酸酶识别并结合至靶序列，以二聚体形式切割DNA产生双链切口（Double strand breaks,DSBs）。细胞在修复DSBs过程中功能实现基因组的靶向编辑，如基因敲入（Geneknock-in），基因敲除（Gene knock-out）,基因修复（Gene correction），基因破坏（Genedisruption）等。锌指蛋白是决定锌指核酸酶结合靶基因特异性和基因修饰高效性的关键因素。现阶段，主要是组装、筛选获得特异锌指蛋白，然后与FokⅠ连接获得活性锌指核酸酶。有研究表明，即使获得的锌指蛋白有DNA识别和结合活性，组装成锌指核酸酶仍然不能切割靶序列。所以，获得活性锌指核酸酶是此技术的难点。此外，锌指核酸酶实现基因组编辑后，如何筛选和富集阳性克隆，获得转基因细胞系也是锌指核酸酶技术应用的关键之一。本论文以奶山羊编码酪蛋白的alpha S1-casein（α S1-casein）为靶基因，利用酵母筛选系统，从锌指核酸酶文库中直接筛选获得活性锌指核酸酶，然后在哺乳动物细胞水平检测锌指核酸酶切割靶序列的活性。最后将锌指核酸酶作用于靶细胞，通过嘌呤霉素药物筛选富集作用，获得基因敲除细胞系，为后续获得转基因奶山羊新品种提供技术支持。同时，基于锌指蛋白和FokⅠ相互作用的独立性，构建了锌指核酸酶介导的酵母杂交系统，为鉴定蛋白与蛋白相互作用提供一种新方法。1．基于开源式（OPEN）筛选方法，构建3个锌指核酸酶随机突变文库。每个文库的三个锌指模块中，一个单锌指模块中识别DNA的关键氨基酸的编码序列以PCR方式实现随机突变，并保持其他两个模块不变，以质粒形式的锌指核酸酶文库库容量达到106~107。根据靶基因α S1-casein的潜在靶序列和OPEN筛选方法，构建9个报告载体。2.基于Gal4蛋白介导的酵母双杂交筛选系统，第一轮筛选富集识别6个三联碱基的单个锌指，将富集的单锌指组装成2个锌指核酸酶重组文库；然后通过第二轮的筛选，获得识别左右单侧9-bp的活性锌指核酸酶；最后通过第三轮针对全长靶序列的筛选，获得3对活性锌指核酸酶。3.构建锌指核酸酶真核表达载体对pST-ZFNL、pST-ZFNR和含靶序列的双荧光报告载体pRFP-EGFP-BS，检测锌指核酸酶在哺乳动物细胞内的切割活性。将锌指核酸酶表达载体和双荧光报告载体共转染至HEK293T细胞。当锌指核酸酶作用于EGFP基因中的靶序列，修复突变的EGFP基因，细胞表现出绿色荧光阳性。利用流式细胞仪检测锌指核酸酶作用后的绿色荧光阳性细胞率，间接反应筛选获得的3对锌指核酸酶切割靶序列活性分别为8.9%，9.3%，5.0%。4.活性锌指核酸酶作用于靶细胞——奶山羊乳腺上皮细胞。将锌指核酸酶载体和报告载体pB-CBA-Puro-BS共同电转染至奶山羊乳腺上皮细胞。基于嘌呤霉素抗性基因的报告载体含有靶序列，当锌指核酸酶切割靶序列，修复报告基因后，细胞在含嘌呤霉素药物的培养基中存活，实现阳性细胞的筛选和富集。然后收集阳性克隆，利用T7核酸内切酶分析基因组中靶序列突变频率。当无报告载体pB-CBA-Puro-BS的富集作用时，我们未检测到基因组靶序列的突变；有报告载体时，利用嘌呤霉素药物筛选富集获得细胞克隆，3对锌指核酸酶实现靶基因突变率分别为9.4%，15.9%和4.1%。5.锌指核酸酶的锌指蛋白ZFP和FokⅠ切割域各司其职，具有相互独立性。将ZFP和X蛋白融合表达，FokⅠ和Y蛋白融合表达，利用X和Y蛋白的相互作用募集ZFP和FokⅠ，形成有活性的重组ZFN，切割靶序列，实现下游报告基因的表达。基于Gal4基因的报告载体，我们验证了蛋白对P53/SV40LT募集活性ZFN，随后利用此系统在cDNA文库中筛选和WDSV的orfA相互作用的蛋白。ZFN介导的此酵母双杂交系统为蛋白与蛋白相互作用鉴定提供一种新方法。