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背景杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是最常见的儿童致死性X连锁隐性遗传病,在活产男婴中的发病率约为1/3500。患儿常在2至5岁之间发病,表现为进行性的肌无力,于青少年时期丧失行走能力,无医疗干预的情况下常于20岁左右死于呼吸或心力衰竭。目前,临床上对于DMD的治疗通常采用长期规律服用糖皮质激素疗法,以减缓疾病的发展进程,辅以康复治疗、呼吸和心脏支持治疗等,但无法改变疾病的最终结局。目前,基因治疗是DMD治疗的研究热点。自2007年Yamanaka发现OSKM(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)四种转录因子可使分化的体细胞重编程为具有多向分化潜能的诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)以来,患者来源的iPSCs就被视为良好的疾病细胞模型。目前已有仙台病毒、附加型载体(episomal plasmid)、microRNA、重组蛋白等多种非整合诱导体系,应用于人成纤维细胞、尿细胞、血细胞、羊水细胞的重编程当中。但患胎绒毛来源非整合诱导多能干细胞仍处于空白。本实验中,通过电转法将表达四种转录因子OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT的oriP/EBNA1附加型载体质粒pEP4-EO2S-ET2K和表达小分子核糖核酸302-306簇的载体质粒pCEP4-mi R-302-367转导入DMD基因第33外显子无义突变的胎儿的绒毛细胞中,诱导非整合DMD-CV-iPSCs克隆产生并鉴定。诱导成功的DMD-CV-iPSCs可作为DMD发病机制研究和基因治疗研究的良好细胞模型。目的构建DMD患胎绒毛细胞来源的非整合诱导多能干细胞系建立及鉴定体系,为后续DMD的发病机制研究和基因组编辑治疗研究提供良好细胞模型。方法选择一DMD基因第33外显子c.4583delA无义突变家系,经孕妇及其家属同意并签署知情同意书后,收集其家系中的经产前诊断确诊为DMD基因第33外显子无义突变男性患胎的废弃绒毛细胞,传代培养。通过电转法将质粒pEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-miR-302-367转导入DMD基因第33外显子无义突变的胎儿的绒毛细胞中,诱导DMD-CV-iPSCs克隆产生。通过染色体核型分析,STR连锁分析和Sanger测序判断DMD-CV-iPSCs与其来源的绒毛细胞间是否存在遗传学差异,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色及畸胎瘤体内分化实验等对DMD-iPSCs的多能性进行鉴定。结果本研究构建了DMD基因第33外显子c.4583delA无义突变患胎来源的DMD-CV-iPSCs细胞系。染色体核型分析、STR连锁分析和Sanger测序结果与患胎绒毛细胞一致,表明DMD-CV-iPSCs来源于患胎绒毛细胞。DMD-CV-iPSCs克隆碱性磷酸酶染色阳性;免疫荧光染色观察到DMD-CV-iPSCs表达多能性标志物Oct4,SSEA4,TRA-1-60及TRA-1-81;畸胎瘤体内分化实验发现免疫缺陷鼠体内注射DMD-CV-iPSCs有明显肿瘤形成,HE染色观察到来自三个胚层的组织,证实DMD-CV-iPSCs有体内多项分化潜能。结论患胎来源的绒毛细胞可被附加型载体质粒重编程为具有多向分化潜能的诱导多能性干细胞,作为DMD基因治疗研究和发病机制研究的良好细胞模型。