研究背景自然杀伤细胞（Natural killer cells,NK cells）是机体固有免疫的重要成员,在抗病毒感染和抗肿瘤应答中发挥第一道防线的作用。NK细胞可以无需预先致敏,直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染免疫细胞,并通过分泌细胞因子发挥免疫调节作用。然而,肿瘤细胞通过多种机制诱导NK细胞数目减少、功能障碍,从而逃避NK细胞的监视,实现免疫逃逸。因此,打破NK细胞的抑制状态或过继转输NK细胞有望成为肿瘤免疫治疗的重要策略之一。代谢稳态在控制NK细胞活化、存活和功能中发挥重要作用。已知静息状态下,NK细胞以氧化磷酸化为主要功能途径,而在活化NK细胞中糖酵解和氧化磷酸化水平均显著增强。阻断糖酵解或氧化磷酸化途径能够显著抑制NK细胞的活化和分泌细胞因子、杀伤靶细胞的能力。研究显示,线粒体是控制NK细胞代谢状态的中枢,而在肿瘤浸润NK细胞（TINK）中线粒体呈现碎片状,线粒体功能稳态受损,导致其存活障碍和功能抑制。反之,改善NK细胞代谢状态,能够增强其抗肿瘤功能。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是细胞内重要的氧化还原酶的氢和电子载体,是连接能量代谢和信号转导的重要桥梁,参与调控代谢、DNA损伤修复、昼夜节律等众多生命活动过程。新近研究发现,NAD+代谢在调控免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞MDSCs等）的稳态、活化、分化和功能中亦发挥重要作用。然而,NAD+代谢在NK细胞调控中的作用尚未见报道。本课题利用体内外实验和临床标本检测,结合数据库分析、转录组测序和质谱检测等技术,以期阐释NAD+代谢在调控NK细胞稳态、活化和功能中的作用,探索基于NAD+代谢的NK细胞治疗新策略。研究方法和结果一、NK细胞活化过程中NAD+代谢增强为初步评估NAD+代谢参与NK细胞活化和效应功能的可能性,本研究首先利用数据库分析、体内外实验检测了 NK细胞活化中NAD+代谢水平的变化。GEO数据库分析发现,NAD+代谢通路在IL-15活化的NK细胞中呈正向富集。与对照NK细胞相比,经IL-15或靶细胞K562活化的NK细胞所共有的差异表达基因中,有4个是NAD+代谢相关的基因,包括Nampt、Nmrk1/2和Qprt。RT-qPCR检测进一步证实,IL-12/IL-15活化的NK细胞中多个NAD+合成相关的基因表达显著上调。同时,液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和/或化学发光检测结果显示,经IL-12/IL-15或NKG2D激动性抗体体外活化的小鼠脾脏NK细胞或人外周血NK细胞中NAD+水平显著升高,且Poly（I:C）处理小鼠的脾脏NK细胞中NAD+水平亦明显高于对照小鼠NK细胞。上述结果显示NK细胞活化过程中的NAD+合成途径激活、NAD+水平升高,提示NAD+代谢可能参与调控NK细胞的活化与功能。二、NAD+促进NK细胞的活化、功能和稳态为明确NAD+代谢在NK细胞活化和功能调控中的作用,以外源NAD+处理小鼠脾脏NK细胞、人外周血NK细胞及NK-92细胞系,检测对NK细胞的活化、功能以及存活能力的影响。结果显示,外源NAD+处理能够上调NK细胞表面活化分子CD69、活化性受体NKG2D的表达,提示补充NAD+能够促进NK细胞活化;相应地,NAD+处理能够提高NK细胞中IFN-γ、TNF-α、Perforin和Granzyme B的表达,以及细胞表面CD107a水平,并能够增强NK细胞杀伤靶细胞的能力,证实NAD+能够增强NK细胞功能。同时,研究发现NAD+亦参与维持NK细胞稳态,表现为NAD+处理的NK细胞具有更强的增殖能力,而凋亡水平降低。以上结果证明,NAD+促进NK细胞活化和功能,并参与NK细胞稳态的维持。三、补救合成途径参与维持NK细胞NAD+代谢和功能稳态哺乳动物中存在三条NAD+生物合成途径,在维持胞内NAD+水平中发挥重要作用。课题进一步通过体内外实验,筛选、明确调控NK细胞中NAD+水平及其功能稳态的主要合成途径。首先,分别以不同NAD+合成途径的前体分子---NMN（补救合成途径的前体）、QA（从头合成途径的前体）和NA（PH合成途径的前体）处理小鼠脾脏NK细胞,化学发光法和LC-MS/MS检测发现NMN处理显著上调IL-12/IL-15活化NK细胞中NAD+及NADH的水平,但QA和NA处理后未见明显影响。相反地,补救合成途径关键限速酶NAMPT的抑制剂FK866处理能够显著下调IL-12/IL-15活化NK细胞中NAD+水平。其次,以前体分子NMN处理小鼠脾脏NK细胞,流式细胞术和ELISA结果显示NMN处理上调NK细胞表面CD69和NKG2D的水平,促进效应分子IFN-γ、TNF-α、Perforin和Granzyme B的表达以及脱颗粒能力;反之,NAMPT抑制剂FK866处理或者干扰Nampt基因表达能够下调NK细胞表面CD69和NKG2D的水平,削弱其效应分子的表达和靶细胞杀伤能力,同时促进NK细胞凋亡、抑制其增殖。上述结果表明,NAD+补救途径在维持NK细胞稳态、促进其活化和功能中发挥重要作用。通过构建NK细胞特异性Nampt基因敲除小鼠,流式细胞术结果显示Nampt基因敲除小鼠中脾脏NK细胞的相对比例及绝对数目均显著低于野生型小鼠,而凋亡NK细胞比例显著升高。同时,Nampt基因敲除的脾脏NK细胞中效应分子的表达亦显著低于对照小鼠NK细胞。以上结果证实NAD+补救途径在NK细胞稳态维持和功能激活中发挥重要作用。四、NAD+补救途径通过改善线粒体代谢、促进NK细胞稳态和功能NAD+作为辅酶或辅因子参与细胞能量代谢和信号转导等众多生命活动过程。为进一步阐明NAD+补救途径影响NK细胞存活和功能的分子机制,课题通过体内外实验,结合转录组测序等技术开展了下述研究。首先,利用RNA-seq技术分析NMN处理对小鼠脾脏原代NK细胞基因表达的影响。差异表达基因分析显示,NMN处理NK细胞中氧化磷酸化相关基因有明显的正向富集,RT-qPCR检测进一步证实FK866处理显著下调NK细胞中ETC基因的表达。透射电子显微镜（TEM）、免疫荧光染色及流式细胞术检测发现,FK866处理的NK细胞中线粒体长度较短、呈现断裂形态,且FK866处理或Nampt基因敲除能够显著下调NK细胞中的线粒体膜电位,上调线粒体ROS水平;反之,NMN处理能够增加NK细胞中线粒体数目和膜电位,下调线粒体ROS水平。其次,Seahorse实验中OCR分析发现FK866处理显著下调NK细胞的基础耗氧量、最大耗氧量、备用呼吸能力和ATP产生,而补充NMN则能够上调NK细胞的氧化磷酸化水平。同时,ECAR检测结果显示,FK866处理显著抑制小鼠脾脏NK细胞的糖酵解活性和最大糖酵解能力,而补充NMN则能够改善NK细胞的糖酵解水平。上述结果证实,NAD+补救途径参与调控NK细胞线粒体稳态和能量代谢。为进一步明确线粒体在NAD+补救途径调控NK细胞功能中的重要性,课题以电子传递链复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮Rotenone预处理小鼠脾脏NK细胞,再给予NMN处理,流式细胞检测结果显示Rotenone预处理能够消除NMN对NK细胞效应分子表达的上调作用,提示NAD+补救途径是通过调节NK细胞中的线粒体稳态进而促进其效应功能。五、肿瘤微环境导致NK细胞中NAD+补救途径受损在肿瘤微环境中,NK细胞呈现功能耗竭表型。因此,课题进一步探究肿瘤浸润NK细胞（TINK）中NAD+代谢异常是否介导了 NK细胞的功能耗竭。RNA-seq分析小鼠肝癌TINK细胞与正常肝脏NK细胞的差异表达基因,GSEA分析结果显示TINK中NAD+代谢相关基因呈负富集状态。体外实验的结果显示,肝癌细胞条件性培养上清（HCM）能够显著降低小鼠脾脏NK细胞中的NAD+水平和NAMPT表达。同时,人的肝癌组织的TINK中的NAD+水平和NAMPT表达均显著低于配对的癌旁组织NK细胞。进一步的TCGA数据库分析显示,TINK中NAMPT的表达与肿瘤组织中浸润的NK细胞数目和患者的生存期正相关。为明确肿瘤微环境中削弱NK细胞NAD+补救途径的关键因素,以肝癌细胞条件性培养上清模拟肿瘤微环境,通过加热处理以及分子筛过滤等等方式进行筛选,结果显示热稳定并且分子量低的小分子介导NK细胞中NAMPT表达的下调。进一步的临床标本检测发现,肝癌组织中乳酸水平显著高于癌旁组织。以不同浓度乳酸处理NK细胞能够剂量依赖性地降低NK细胞中NAMPT表达,且能够下调人NAMPT基因的启动子区活性。反之,以单羧酸盐转运体（MCT1/2）的抑制剂AR-C155858阻断乳酸摄取后,能够消除HCM处理导致的NK细胞中NAMPT表达下调。上述结果证实,肿瘤微环境中乳酸水平的升高导致TINK细胞中NAD+补救途径受损。六、NK细胞中NAD+补救途径受损促进肿瘤生长为进一步明确NK细胞中NAD+补救途径受损在肿瘤发生发展中的作用,分别利用NK细胞特异性Nampt基因敲除小鼠及野生型小鼠建立肝脏自发肝癌模型。活体生物发光成像结果显示,NK细胞特异性Nampt基因敲除小鼠中肝癌的生长明显加重,生存期缩短,且TINK细胞的中细胞因子IFN-γ、TNF-α及穿孔素、CD107a的水平显著低于对照组小鼠。相类似地,在黑色素瘤模型中,NK细胞特异性Nampt基因敲除小鼠的肿瘤生长速度更快,且TINK细胞中效应分子的表达显著降低。上述结果证实,NK细胞中NAD+补救途径的缺失导致其抗肿瘤功能受损,促进肿瘤的发生发展进程。七、NMN改善TINK细胞的线粒体稳态和效应功能以上的结果表明NAD+补救途径在维持NK细胞功能稳态中发挥重要作用,而补救途径受损能够抑制NK细胞功能、促进肿瘤发生。为探索基于靶向NAD+代谢能够改善TINK细胞的稳态和功能,课题首先通过体外实验检测了 NMN处理对于人或小鼠肝癌TINK细胞功能和线粒体稳态的影响。流式细胞术检测结果显示,NMN处理能够显著提高人或小鼠肝癌TINK中IFN-y、TNF-α、Granzyme B和Perforin的表达,以及脱颗粒和靶细胞杀伤能力。相应地,NMN处理能够下调TINK细胞中线粒体去极化细胞的比例,降低线粒体ROS水平。上述体外实验证实,补充NAD+补救途径能够显著改善TINK细胞线粒体稳态和效应功能。八、补充NMN改善NK细胞的抗肿瘤疗效为进一步验证NAD+补救途径是否可以作为基于NK细胞肿瘤治疗的干预靶点,课题利用HepG2-luciferase细胞和NCG小鼠构建人类肝细胞肝癌模型,分别转输对照或NMN处理的NK-92细胞。活体生物发光成像和生存期分析显示,NMN处理的NK92细胞转输组小鼠肝癌细胞的生长明显减慢,生存期显著延长。此外,在小鼠黑色素瘤模型中,NMN处理的脾脏NK细胞能够显著抑制黑色素瘤的生长,具有更好的抗肿瘤效果。综上所述,补充NMN改善NK细胞的NAD+代谢,能够增强NK细胞的抗肿瘤功能,可作为基于NK细胞的肿瘤免疫治疗的潜在干预策略。研究结论及意义:本课题首次鉴定NAD+通过维持线粒体稳态进而促进NK细胞存活及功能,明确了补救途径的激活是维持NK细胞中NAD+水平的重要机制。在肿瘤浸润NK细胞中NAD+补救途径及NAD+水平受损,导致NK细胞存活和抗肿瘤功能受损,加速肿瘤的发生发展,而NMN的补充增强了NK细胞的抗肿瘤活性。该研究揭示了 NAD+代谢在控制NK细胞功能稳态中的关键作用,为以NK细胞为靶点的肿瘤免疫治疗提供了新的思路。