肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,近年来在我国和其他国家肺癌的发病率和死亡率已经上升为恶性肿瘤的第一位,由于大气污染加重等因素,肺癌的发病率和死亡率均呈明显上升的趋势。由于肺癌诊断技术的不完善,许多肺癌患者在就诊时已经失去了最佳的治疗时间,因此肺癌的诊断显得尤为重要。目前,临床常用的H.E染色法难以完全准确地判断出肿瘤的性质,而免疫组织化学不仅能准确地诊断出肿瘤的性质,还可以预测肿瘤预后的生物学行为。其次,免疫组织化学技术还可以指导某些肿瘤的化疗,其在确定组织起源的应用前景是无限的。所以,研制肺癌的免疫组织化学诊断试剂药盒,在肺癌的早期确诊、预防和治疗等方面具有重要价值和实际应用意义。本课题采用BALB/c小鼠体内生产单抗的方法制备肺癌单克隆抗体,采用辛酸-硫酸铵法纯化肺癌单抗,纯化后的单抗浓度为3.0426mg/ml,纯度为80%-90%,已达到电泳纯。采用免疫组化法鉴定肺癌单抗的特异性,结果显示肺癌单抗是针对大细胞肺癌的特异性抗体;采用免疫印迹法对大细胞肺癌相关蛋白进行鉴定,结果显示肺癌单抗针对大细胞肺癌的蛋白为NCIH460细胞质内约90KD的蛋白质。用纯化后的肺癌单抗对新西兰大白兔进行长程免疫,四次免疫后检测效价可达到1:1024000以上,采用颈动脉采血后用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清,纯化后兔血清IgG的浓度为28.5468mg/ml,纯度为80%-90%,已达到电泳纯;采用过碘酸钠氧化法酶标记纯化后的兔抗肺癌单抗抗体,用直接ELISA法测定其效价和特异性:酶标后的效价可达到1:32000以上,酶标抗体作为试剂盒的第二抗体;酶标兔抗肺癌单抗的抗体中HRP浓度为1.584 mg/ml, IgG浓度为2.5056mg/ml ,HRP/IgG比约为1.60,酶结合率为31.68%,达到酶标二抗理化性质的标准。建立肺癌免疫组化检测试剂盒,试剂盒中过氧化物酶祛除剂反应的最佳浓度和反应时间为3%过氧化氢/甲醇室温静置10 min;封闭液的最佳反应温度和时间为37℃温育20 min;一抗反应的有效范围为1:50-1:500,稀释度为1:100,最佳反应温度和时间为37℃温育1h,用量为100ul;二抗反应的有效范围为1:50-1:800,稀释度为1:200,用量为100ul,最佳反应温度和时间为37℃温育30min;选用的DAB染色剂时间应该控制在30-50s之间,复染时选用的苏木素时间应该控制在15-30s之间,最佳用量为覆盖住切片中的病理组织即可。