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超感染排斥（Superinfection Exclusion,SIE）是细胞或宿主被病原感染后抑制相同或相似病原再次侵染的一种现象,在病毒、细菌间广泛存在。借助SIE,低抗体宿主可以利用弱毒株阻碍强毒株的感染,为临床疫病防控提供新的思路。新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种对禽类有重大危害的传染病,目前防控措施主要依赖疫苗接种。NDV SIE现象已有文献报道,有研究提出NDV SIE可能与血凝素神经氨酸酶（Hemagglutinin-neuraminidase protein,HN）蛋白有关。HN蛋白作为NDV识别、吸附宿主细胞以及从细胞中释放子代病毒的必备条件,在NDV感染的整个生命周期中扮演着重要角色,但目前HN蛋白如何参与到NDV SIE中尚未见报道,另外是否存在其他因素促成NDV SIE的发生也未可知。本研究主要聚焦于NDV SIE发生机制的探索,具体研究内容及结果如下:（1）NDV的SIE细胞模型的建立。为了研究NDV的SIE机制,需要利用不同表型的NDV毒株先后感染细胞,观察细胞第一次被病毒感染后抑制NDV再次感染的能力,从而建立NDV的SIE模型。用表达不同荧光蛋白的NDV毒株间隔不同时间感染DF-1、BHK-21等细胞,通过荧光显微镜观察、流式细胞仪、Q-PCR、WB等相关试验,从细胞、蛋白、RNA水平,定性和定量分析已被NDV感染的细胞排斥病毒再次感染的能力。发现细胞被NDV感染后的2 h就能排斥NDV的再次感染,排斥程度随着两次病毒感染间隔时间的延长逐渐变强,成功建立NDV的SIE细胞模型。进一步研究发现,这种SIE具有种间特异性,能在NDV弱毒与弱毒、弱毒与强毒之间发生,但不能在NDV和水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus,VSV）之间发生,表明NDV的SIE与病毒自身有关,与引起细胞的广谱抗病毒的天然免疫无关。（2）HN蛋白调控NDV SIE的机制。为了探究HN蛋白调控NDV SIE的分子机制,首先构建了NDV HN蛋白真核表达载体以及拯救表达NDV HN蛋白的小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）PPRV-HN-GFP。用真核质粒转染或重组PPRV病毒感染细胞后,证实了HN蛋白成功表达,并且检测到了HN蛋白相关的红细胞吸附（Hemadsorption,HAd）、神经氨酸酶（Neuraminidase activity,NA）、促膜融合活性。质粒转染或PPRV-HN-GFP毒株感染后,再用NDV毒株感染相关细胞,并对NDV感染水平进行检测。发现无论是在质粒水平还是病毒水平,均证明提前表达的HN蛋白对NDV感染具有排斥作用。其次,通过点突变,获得了HAd活性和NA活性缺失、降低或增加的HN蛋白突变体的真核质粒,并通过反向遗传技术拯救了嵌合这些HN蛋白突变体的PPRV毒株。质粒转染或重组PPRV毒株感染细胞后,再用NDV感染。采用SIE细胞模型建立时的相关方法,在细胞、蛋白和RNA水平均发现HN蛋白通过NA活性调控病毒的SIE。然而,NDV感染细胞后2～6 h,基本检测不到HN蛋白的表达及NA活性,表明在病毒感染早期的SIE可能由NDV的其他成分调控。（3）核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）调控NDV SIE的机制。为了探究除HN蛋白,是否还有其他病毒蛋白参与NDV的SIE。构建了NDV所有蛋白的真核表达质粒,通过细胞转染、病毒感染、感染情况监测等,发现细胞中存在病毒的NP蛋白也能抑制NDV的感染。拯救表达NP蛋白的PPRV毒株（PPRV-NP-GFP）,感染细胞后检测到NP蛋白的表达,且能驱动NDV微型复制子（微基因组）的表达,并证实NP蛋白抑制NDV的感染。为了研究NP蛋白引起NDV SIE的机制,构建了NP蛋白氨基末端（N端）和羧基末端（C端）截短不同长度的质粒,转染细胞后感染NDV,结果定位到N端1～40位氨基酸序列和C端353～489位氨基酸序列是NP蛋白参与NDV SIE的关键序列。拯救表达NP截短蛋白的重组PPRV毒株PPRV-NPΔN41-GFP和PPRV-NPΔC352-GFP。重组毒株在细胞内表达后分别感染NDV,结果证明,相比野生型的NP蛋白,敲除N端1～40位氨基酸的NP蛋白截短体丧失抑制NDV感染的能力,NP蛋白C端353～489氨基酸敲除的NP蛋白降低了抑制NDV感染的能力。进一步的研究表明,这种调控NDV SIE的能力与NP蛋白自我聚集的程度呈正相关。野生性NP蛋白提前表达于细胞中后自我聚集形成淀粉样颗粒的能力明显强于NPΔC352,NPΔN41截短体几乎检测不到蛋白的自我聚集。然而,NP蛋白自我聚集如何调控NDV的SIE机制还有待进一步研究。综上所述,从蛋白水平出发,NDV的SIE的主要由病毒HN蛋白和NP蛋白调控。本研究首次发现并证实了HN蛋白通过NA活性,NP蛋白通过自我组装聚集特性参与NDV的SIE,为探索其他病毒SIE的机制提供了思路。