非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirus virus,ASFV）引起猪的一种病毒性出血性疾病,强毒株可引起家猪接近100%的死亡率。该疾病具有高度传染性,对养猪行业构成巨大威胁并且危害全球贸易。中国生产的猪肉约占全球供应的50%,ASF对中国的影响尤其严重。目前缺乏针对ASFV有效的疫苗和治疗药物,防控主要依靠快速有效的检测、扑杀感染猪以及加强生物安全措施。H240R蛋白是ASFV的一个次要衣壳蛋白,对ASFV二十面体衣壳的形成和感染性粒子的产生是至关重要的。目前关于H240R蛋白的相关研究较少,对于H240R蛋白在ASFV组装中的具体机制及其它生物学功能仍需进一步研究。本研究通过原核表达两种形式的H240R蛋白,纯化后免疫小鼠,制备针对ASFV H240R蛋白的单克隆抗体并进一步鉴定单克隆抗体的生物学特性,研究内容及结果如下:1.非洲猪瘟病毒单体和颗粒化H240R蛋白的原核表达与纯化构建p ET-29b-H240R重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。通过镍亲和层析和凝胶过滤层析对其纯化,SDS-PAGE分析结果表明得到纯度较高的单体H240R蛋白。质谱结果表明,单体H240R蛋白之间存在二硫键结构。为了提高H240R蛋白的免疫原性且维持其五聚体结构,选用五聚体构型的52B蛋白与H240R蛋白融合表达,再将其与二聚体形式的52A蛋白混合形成纳米颗粒。即分别将H240R-52B、52A和52B基因插入到p ET-29b载体上合成全基因后转化进BL21感受态细胞进行原核表达,利用镍柱进行纯化。将纯化后的H240R-52B和52A蛋白按照等摩尔比混合后利用动态光散射仪测定尺寸,结果显示形成一个直径为34.4 nm的颗粒化H240R蛋白。52B蛋白用于后续颗粒化H240R蛋白单克隆抗体的筛选。2.非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的制备将等量的单体和颗粒化H240R蛋白分别皮下免疫BALB/c小鼠,免疫间隔为21天。在第四次免疫之后,利用间接ELISA方法测定小鼠血清效价,分别选取血清效价最高的4号和6号小鼠进行超免,用于细胞融合。通过间接ELISA方法筛选和三次亚克隆,共得到10株杂交瘤细胞株,分别命名为13E11、2H7、13D2、21G3、14E16、17F12、18F10、11B9、8G7和12D6。3.非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的鉴定间接ELISA检测10株单克隆抗体的亲和活性,抗体效价均在80 000-1 280 000。将冻存3个月以上的10株杂交瘤细胞株复苏后培养,检测细胞株分泌抗体的稳定性,结果表明有7株能稳定分泌抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果为Ig G2b和Ig G1,轻链亚类均为Kappa。Western blot和Dot blot试验表明有8株单克隆抗体识别的是H240R蛋白的线性表位而其余2株单克隆抗体识别的是构象表位。为鉴定单克隆抗体与真核表达的H240R蛋白的反应性,构建p CAGGS-HA-H240R重组载体,转染至HEK293T细胞,IFA结果显示10株单克隆抗体均能与真核表达的H240R蛋白反应。IPMA试验显示,所有的单克隆抗体均能与ASFV HLJ/18分离株反应。利用猪的其他5种无关病毒抗原进行交叉反应性试验,结果表明10株单克隆抗体均具有良好的特异性。此外,为评估单克隆抗体用于ASFV诊断上的潜力,进行竞争ELISA试验。结果显示单抗17F12能与ASFV阳性血清很好地竞争结合H240R蛋白,抑制率达到77%。将H240R基因截短表达,对单抗识别的线性表位进行初步鉴定,结果显示单抗18F10识别H240R蛋白的N端（1-155aa）,单抗13E11和13D2识别该抗原的C端（127-240aa）。综上所述,本研究成功表达并纯化出单体和颗粒化ASFV H240R蛋白,且颗粒化H240R蛋白的免疫原性明显高于单体蛋白。共筛选到10株能与H240R蛋白特异性反应的高亲和力单克隆抗体,其中有7株具有稳定分泌抗体的能力,单抗17F12表现出较好地与ASFV阳性血清竞争结合H240R蛋白的能力,并且发现H240R蛋白的N端和C端存在不同的抗原表位。这些结果不仅丰富了H240R蛋白抗原的知识,同时也为ASFV亚单位疫苗的研发以及血清学诊断提供新的靶标。