背景:随着人们生活习惯和饮食结构的改变,近年来结肠癌的发病率有所增加,发病率占肿瘤的8.7%。结肠癌的防治研究形式紧迫,探索结肠癌的发病机制,寻找与结肠癌诊断和治疗相关的新靶点,具有非常重要的理论意义和现实价值。一般认为,结肠癌有两种主要的发生机制,染色体不稳定（chromosomal instability,CIN）和微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）,它们会导致一系列基因的突变,包括APC、TP53、KRAS、PI3KCA、BRAF、NRAS和SuFu等。据报道,Hedgehog（Hh）信号在结肠癌中异常激活并影响结肠癌的发生和发展,但详细的分子机制尚不清楚。Hedgehog（Hh）信号通路最初是由Wieschaus和Nüsslein-Vollhard于1980年在果蝇体节发育基因突变的遗传分析中发现。Hh信号通路在调节机体发育的过程中至关重要,Hh信号传导障碍会导致多种发育缺陷。在成体中,Hh信号的异常激活与结肠癌等多种肿瘤的发生发展密切相关,但其详细的分子机制尚有待进一步研究。HOIP是目前唯一已知介导线性泛素化的E3泛素连接酶,主要参与免疫调控。HOIP介导的线性泛素化修饰在细胞信号转导中的作用研究并不多,目前已知的功能研究集中在NEMO的线性泛素化介导NF-κB信号传导途径,从而调控细胞死亡过程和机体免疫等生理作用。然而,HOIP及其介导的线性泛素化修饰在Hedgehog信号通路中的功能尚未见诸报道,而HOIP对结肠癌细胞的发生、发展的影响也尚不清楚。研究目的:本课题将通过研究HOIP在结肠癌中的基因表达、细胞功能、分子机制和病理作用,阐明HOIP通过调控Hh信号,促进结肠癌生长的功能和机制。1、基因表达:检测HOIP在结肠癌中的表达变化;2、细胞功能:阐明HOIP调控Hh信号的细胞学功能;3、分子机制:阐明HOIP介导Gli的线性泛素化以稳定Gli的分子机制;4、病理作用:探讨HOIP是否调控结肠癌细胞增殖的病理作用。研究方法:1、通过对公共数据库的分析,在TCGA临床队列中检测HOIP在结肠癌组织中的表达,并且建立HOIP表达与结肠癌预后的相关性。收集结肠癌临床样本,通过免疫组化、免疫印迹的方法检测结肠癌组织及其癌旁组织中HOIP的蛋白质表达水平,从而进一步验证HOIP在结肠癌中的表达变化。2、在结肠癌细胞系HCT116中过表达或干扰HOIP蛋白的表达。然后,通过双荧光素酶报告系统检测Hh信号通路的激活情况,从而阐明HOIP对Hh信号的调控作用。3、在模式细胞系HEK293T中过表达HOIP,通过免疫印迹检测HOIP对Gli蛋白水平的影响,并通过免疫共沉淀的方法进一步验证HOIP与Gli之间的相互作用。然后利用环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白质翻译后,检测HOIP对Gli蛋白降解速率的影响。在细胞中分别转染LUBAC复合物的三个组分:HOIP、Sharpin、HOIL1L,通过免疫印迹和免疫共沉淀的方法研究LUBAC复合物的其他组分对Gli蛋白水平的影响。分别克隆和表达UBAN^NEMO和NZF^TAB2结构域,通过免疫共沉淀的方法,利用这两个结构域来识别和富集线性泛素链和K63-泛素链,然后再将底物蛋白Gli3的抗体用于免疫印迹实验,以检测Gli3的泛素化类型。另外,我们将建立一系列表达质粒,在HEK293T细胞中转染Gli2、Gli3、野生型HOIP以及HOIP的截短突变体,通过免疫共沉淀寻找介导Gli2与HOIP结合的结构域,并通过免疫印迹实验检测HOIP及其截短突变体对Gli3泛素化水平的影响。4、在结肠癌细胞系（HCT116、HT29、SW480、SW620）中,通过免疫印迹的方法检测这四个细胞系中HOIP的表达,并通过细胞计数和平板克隆形成实验的检测结肠癌细胞增殖的情况。研究结果:1、通过利用TCGA数据库分析发现在结肠癌组织中HOIP的mRNA水平要高于正常组织,并且HOIP的高表达会影响患者的预后。免疫组化和免疫印迹实验表明在结肠癌组织中HOIP的蛋白水平高于正常组织。2、通过双荧光素酶报告基因检测实验,发现过表达HOIP会增加8×GBS的活性,敲低HOIP的表达会后8×GBS的活性随之降低,表明HOIP调控Hh信号通路。3、在HEK293T以及HT29、HCT116中,通过免疫印迹实验发现HOIP和Gli蛋白二者之间有相互作用,过表达HOIP会增加Gli蛋白的稳定性,并且会延长Gli蛋白的半衰期。通过检测Gli蛋白的泛素化水平表明HOIP能够介导Gli蛋白的线性泛素化从而稳定Gli。4、通过细胞计数实验和平板克隆形成实验表明HOIP会增加结肠癌细胞的增殖能力和平板克隆能力。结论:1、HOIP在结肠癌组织中高表达。2、HOIP激活Hh信号。3、HOIP能够与Gli蛋白相互作用并介导其线性泛素化,从而稳定Gli。4、HOIP激活Hh信号促进结肠癌细胞的增殖。