论文部分内容阅读
研究背景课题组前期研究结果发现,小鼠胚胎植入期CS：暴露可明显降低胚胎植入数目,且植入数目的降低与子宫内膜相关粘附分子蛋白表达的降低有关。特别是作为子宫内膜容受性标志分子的整合素aVp3及对其表达有明显促进作用的白血病抑制因子(LIF),但CS2暴露致蛋白表达明显降低的机制尚不明确。因此探讨CS2暴露下粘附分子表达降低的原因,对于揭示CS2的胚胎毒作用机制及预防和控制CS2的危害具有深远的意义。流行病学研究调杳显示子宫组织整合素αvβ3mRNA表达的降低可能是导致不孕症的原因之一。另外有研究表明LIFmRNA表达水平的降低可能与雌(女)性着床失败有关。以往研究发现,外源性化合物暴露可以通过影响基因转录效率即]mRNA水平进而干扰蛋白质的表达。因此,研究在胚胎植入这个特定时期内整合素αVβ3和LIFmRNA的表达规律及CS2暴露对其影响,对于探讨CS2暴露致整合素αVβ3和LIF蛋白表达异常的可能原因、揭示CS2的胚胎毒作用机制具有重要的意义。表观遗传是指在DNA序列没有发生改变的前提下,基因表达发生了可遗传的变化。DNA甲基化,是表观遗传变异的主要形式,主要发生在基因启动子区域CpG岛的胞嘧啶上,需要甲基转移酶(DNA methyltransferase,即DNMT)的参与。DNA甲基化同时也是调节基因表达的重要机制,可影响基因的转录过程,在胚胎发育和胚胎植入过程中也起着重要作用。以往研究发现DNA甲基化可以通过调节钙粘连蛋白和HOX10蛋白的表达来影响子宫内膜的容受性。因此,研究CS2暴露对整合素αVβ3和LIF基因启动子区甲基化状况的影响,阐明DNA甲基化与整合素αVβ3及LIFmRNA表达的关联性,可更深入探讨C82暴露下整合素αVβ3及LIF蛋白表达异常的原因。因此,本课题拟通过检测胚胎植入期CS2暴露后孕鼠子宫组织整合素αVβ3和LIFmRNA表达情况,并从表观遗传学角度,探讨CS2暴露致粘附分子相关蛋白表达水平降低的原因,从而揭示CS2暴露致胚胎植入障碍机制。研究目的构建胚胎植入期不同时间点暴露C82致胚胎植入障碍模型,观察小鼠胚胎发育以及胚胎植入障碍现象,检测不同暴露时间不同观察终点孕鼠子宫组织中整合素αVβ3、LIFmRNA表达水平,测定各观察终点整合素αVβ3及LIF基因启动子区CpG岛甲基化情况,并检测DNMT1mRNA表达情况,以期研究整合素αVβ3和LIF基因启动子区甲基化变化情况与基因表达改变的关系,从而探讨整合素αVβ3、LIFmRNA水平及其基因甲基化状态在胚胎植入期CS2暴露致其蛋白表达水平降低中的作用。研究方法1.建立动物模型SPF级性成熟KM小鼠适应性饲养一周后,按雌雄1：1交配合笼,次日晨8点检查阴栓,阴栓阳性者记为孕第1天(GD1)。将孕鼠随机分为GD3暴露的GD4、GD5、GD6、GD7观察终点及其对照组,GD4暴露的GD5、GD6、GD7观察终点及其对照组,GD5暴露的GD6、GD7观察终点及其对照组以及GD6暴露的GD7观察终点及其对照组。共10个暴露组和10个对照组。分别在各个暴露时间点,按照当日孕鼠体重以631.4mg/kg (0.4LD50)的剂量对孕鼠行腹腔注射CS2一次,对照组给予橄榄油。在各个相应观察终点脱臼处死小鼠后称取子宫、卵巢、肝、脾、肾的重量,子宫迅速称量后,置入液氮速冻,-80℃保存,血清-20℃保存待用。2.各观察终点孕鼠子宫组织中整合素αVβ3及LIFmRNA水平的检测应用半定量RT-PCR方法检测胚胎植入期CS2暴露各相应观察终点孕鼠子宫组织中整合素αVp3及LIFmRNA水平。3.各观察终点孕鼠子宫组织中DNMT1mRNA水平的检测应用半定量RT-PCR方法检测胚胎植入期C82暴露各相应观察终点孕鼠子宫组织中DNMT1mRNA表达水平。4.各观察终点孕鼠子宫组织中整合素avP3及LIF基因启动子区CpG岛甲基化检测应用甲基化特异性PCR法(MSP)和碱性磷酸盐直接测序法(BSP)检测整合素αVβ3及LIF基因启动子区CpG岛的甲基化情况。5.统计学分析方法实验数据分析处理采用spssl7.0软件,P<0.05认为有统计学意义。先进行方差齐性检验,对各个基因mRNA目对含量进行正态性检验,采用两组独立样本的t检验比较暴露组与对照组两组之间的差异。对于各个暴露组各基因甲基化程度的差异等计数资料,采用X2检验。研究结果1.胚胎植入期CS2暴露所致母体毒性作用各暴露组孕鼠子宫、卵巢、肝脏、脾脏及肾脏重量与相应的对照组相比均没有统计学差异；各暴露组肝脏系数、脾脏系数及肾脏系数与相应的对照组比较差别没有统计学意义；而子宫系数和卵巢系数与相应的对照组比较差异有统计学差(?)的母体毒性。2.CS2暴露对孕鼠子宫组织整合素αvβ3mRNA表达的影响孕鼠在GD3暴露于CS2后在GD4和GD5观察终点,子宫组织整合素αVβ3mRNA表达水平分别较对照组降低了33.21%和35.65%(P<0.05)；孕鼠在GD4暴露于CS2后在GD5和GD6观察终点,子宫组织整合素αvβ3mRNA表达水平较对照组分别降低了44.08%和28.06%(P<0.05)；孕鼠在GD5暴露于CS2后在GD6观察终点,子宫组织中整合素αvβ3mRNA表达水平较对照组降低了26.71%(P<0.05)；孕鼠在GD6暴露于C82后在GD7观察终点,子宫组织整合素αVβ3mRNA表达水平较对照组降低了35.91%(P<0.05)。上述结果表明,孕鼠在胚胎植入期不同时间点暴露于CS2可导致子宫组织整合素αvβ3mRNA表达水平降低。3.CS2暴露对孕鼠子宫组织LIFmRNA表达的影响孕鼠在GD3暴露于CS2后在GD4观察终点,子宫组织LIF mRNA表达水平较对照组降低了35.13%(P<0.05)；孕鼠在GD4暴露于C82后在GD5、GD6和GD7观察终点,子宫组织LIF mRNA表达水平较对照组分别降低了39.98%,17.13%和18.11%(P<0.05)；孕鼠在GD5暴露于CS2后在GD6观察终点,子宫组织LIF mRNA表达水平较对照组降低了29.92%(P<0.05)；孕鼠在GD6暴露于CS2后在GD7观察终点,子宫组织LIF mRNA表达水平较对照组变化不明显(P>0.05)。由上述结果可以看出：孕鼠在胚胎植入期暴露于CS2可以导致子宫组织LIFmRNA表达水平明显降低。孕后GD4胚胎植入期暴露于CS2其子宫组织LIFmRNA降低较明显。4.CS2暴露对孕鼠子宫组织甲基转移酶DNMT1mRNA表达的影响孕鼠在GD3暴露于C82后在GD4观察终点,子宫组织DNMT1mRNA表达水平较对照组降低了35.13%(P<0.05)；孕鼠在GD4暴露于CS2后在GD6观察终点,子宫组织DNMT1mRNA表达水平降低了33.60%(P<0.05)由以上结果可以推测孕鼠植入期暴露CS2可以导致其子宫组织中DNMT1mRNA表达水平的改变。5.各个暴露组不同观察终点整合素αVβ3和LIF基因启动子区甲基化情况采用Methprimer软件对整合素αVβ3的启动子区进行CpG岛检测结果显示,该区域存在一个CpG岛,长度为200bp,存在14个CpG位点。选取整合素αvβ3mRNA表达水平发生明显改变的GD4组和相应的对照组采用直接测序法(BSP)检测样本甲基化水平。每只孕鼠BSP挑取5条克隆测序。测序结果显示,暴露组和对照组在14个甲基化位点的甲基化模式的改变没有统计学差异。同时,采用Methprimer软件对LIF的启动子区域进行CpG岛检测,结果显示该区域无CpG岛存在。说明LIF基因发生甲基化的概率亦不大。提示本研究中孕鼠暴露于CS2后致子宫组织整合素αVβ3和LIF mRNA表达水平的改变与其基因甲基化作用的关联性较小。结论1.孕鼠于植入期暴露于CS2可以降低子宫组织整合素αVβ3和LIF mRNA表达水平。提示mRNA水平降低可能是整合素αVβ3和LIF蛋白表达水平降低的主要原因之一,可能是胚胎植入期暴露于CS2致胚胎植入障碍的重要机制；胚胎植入期GD4暴露是CS2致子宫组织中整合素αVβ3和LIFmRNA表达水平改变的敏感期。2.植入期CS2暴露并没有明显改变孕鼠子宫组织整合素αVβ3基因启动子区的甲基化状态。提示整合素αvβ3mRNA表达水平的降低与其基因启动子区甲基化情况无明显关联。LIF基因启动子区无CpG岛存在,发生甲基化的概率亦不大。可以推测,本研究中DNA甲基化并非是胚胎植入期CS2暴露致整合素αVβ3和LIF蛋白表达水平降低的可能机制,其具体机制尚需进一步研究。