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目的：通过建立肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人晶体上皮细胞(HLE-B3)炎症损伤模型，观察炎症损伤后细胞性状的改变，研究核因子-kB(NF-κB)在炎症损伤中的表达变化及作用。利用RNA干扰(RNAi)技术，探讨人NF-κB P65小干扰RNA(siRNA)转染HLE-B3细胞后对炎症损伤诱导的NF-κB及下游因子表达的抑制作用。方法：1．将人重组TNF-α加入HLE-B3细胞的培养液中，使终浓度为20ng／ml，分别孵育6h、24h及48h以制备HLE-B3细胞的炎症损伤模型。倒置显微镜下观察细胞性状的变化，采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR的方法，分别检测NF-κB P65蛋白及其mRNA的表达变化。2．采用荧光标记siRNA与转染试剂HiperFect的不同浓度组合，分别转染HLE-B3细胞，12h后在荧光倒置显微镜下观察转染效率，MTT法检测转染复合物的毒性，对转染条件进行优化。3．设计并体外转录合成3条人NF-κB P65 siRNA，分别转染HLE-B3细胞，通过实时荧光定量PCR的方法检测NF-κB P65 mRNA的表达变化，筛选出抑制效率最高的siRNA。4．采用筛选出的siRNA与优化后的转染条件对HLE-B3细胞进行转染，24h后加入TNF-α进行诱导，并分别于诱导后不同时间收集细胞及培养液，实时荧光定量PCR法检测NF-κB P65 mRNA的表达，ELISA法检测培养液中下游因子IL-1β和TGF-β的含量。结果：1．TNF-α刺激后HLE-B3细胞胞体伸长变细，细胞形态类似成纤维细胞，细胞间“拉网现象”消失。免疫组化染色显示：正常HLE-B3细胞胞浆中即可见少量NF-κB P65蛋白的表达，TNF-α刺激后6h，NF-κB阳性表达量增多，且胞核染色阳性，刺激后24h、48h NF-κB表达进一步增多，染色由黄色到棕黄色。定量PCR结果显示：与正常对照组比较，TNF-α刺激后6h NF-κB mRNA表达量明显增高，刺激后24h比6h时NF-κB mRNA表达量进一步增高，而24h与48h比较差异无显著意义。2．实验结果显示：增加siRNA的量可以提高转染效率，但siRNA的量为10nM和25nM时转染效率无明显差异。HiPerFect的剂量≤3.0μl时转染复合物的细胞毒性较小，细胞存活率可达80％以上，但是当HiPerFect的剂量增加至4.5μl时，其细胞毒性显著增加。在转染混合物的组成为10nM siRNA与3.0μlHiPerFect时转染效率最高达73.3％，并且仍能保证80％的细胞存活率。3．实时荧光定量PCR证实：设计并体外转录合成的3条NF-κB p65 siRNA转染HLE-B3细胞后，有2条能够使细胞NF-κB p65 mRNA的表达明显减少，并且其中1条的抑制作用可以达到82％。4．定量PCR结果显示：与正常组比较，转染24h后(即加入TNF-α前)，siRNA组与TNF+siRNA组NF-κB p65 mRNA的表达明显减少，加入TNF-α后TNF组NF-κB p65 mRNA明显增加，TNF+siRNA组虽有增加但仍低于正常细胞水平。双抗体夹心法ELISA结果显示：各实验组的细胞培养液中IL-1β、TGF-β的含量变化规律与NF-κB p65 mRNA的变化规律相一致。结论：1．应用rhTNF-α进行刺激是建立HLE-B3细胞炎症损伤模型的有效方法。2．HLE-B3细胞炎症损伤模型中NF-κB被活化并表达增加，NF-κB可能是外伤障中开启炎症损伤的关键因子。3．经过转染条件的优化，转染试剂HiperFect能将siRNA高效的转染进HLE-B3细胞。4．自行设计合成的NF-κB siRNA转染进细胞后可以有效地实现对相应的内源性RNA的降解。5．利用RNA干扰的方法可以有效的抑制TNF-α诱导的HLE-B3细胞内NF-κB及下游因子IL-1β、TGF-β的表达上调，从而抑制对HLE-B3细胞的损伤作用。