益生菌作为替代抗生素新型的饲料添加剂,受到人们的广泛关注。尤其是酿酒酵母作为益生菌广泛应用到各种水产动物当中,并获得促进水产动物生长,增加先天免疫反应应答和保护宿主抵抗致病菌感染和侵害益生效果。本论文主要研究1.在高密度养殖模式条件下,2.不同蛋白类型的基础饲料鱼粉型(饲料A)和豆粕型(饲料B)条件下,添加活啤酒酵母和热灭活酵母对罗非鱼的影响。研究的主要内容包括生长、肠道粘膜形态和肠消化酶活性、免疫相关因子、肠道粘附和非粘附菌群以及对致病菌抗病力。同时,研究饲料中添加啤酒酵母培养物或活细胞与解淀粉芽孢杆菌孢子混合添加剂对鲤鱼生长,肠道粘膜形态,热应激蛋白HSP70表达以及抗病力的检测。一、高密度养殖3组每缸24尾鱼(密度为4.12g/L),分别为:加1g/kg活酵母(LY,Lesaffre公司Actisaf®酵母);加1g/kg热灭活酵母(HIY)和无酵母添加组(CK);低密度无酵母组(Low CK),每缸12条鱼(密度为2.06g/L),每个实验组4个重复。不同处理组生长相关参数结果均无显著差异。肠粘膜形态分析,相比CK组,LY组肠微绒毛高度显著增加,但与Low CK组无显著差异,HIY组对肠微绒毛长度无显著性变化。各个处理组中罗非鱼肠微绒毛密度没有显著差异。在免疫相关结果分析:肠hsp70和tgf-β表达量在各个处理组中无显著性变化。相比Low CK组,肠il-1β表达量在LY组中显著上调,但与CK组相比,无显著性差异;相比CK组和Low CK组,肠tnf-α表达量在HIY组中显著上调,而LY组中无显著性差异。头肾中,相比CK组,hsp70表达量在LY组中显著下调,但与Low CK组相比无显著差异;然而,相比CK组和Low CK组,hsp70表达量在HIY组中显著上调。相比CK组和Low CK组,il-1β表达量在LY组中显著上调。Tnf-α和tgf-β相对表达量在不同处理组中没有显著性差异。相比CK组,肠道碱性磷酸酶活性在LY组和Low CK组中显著降低,而HIY组无显著性变化。这表明添加活酵母(LY)有抵抗致病菌感染的作用。肠道菌群分析:相比CK组和Low CK组,LY组中变形菌门的百分比增加,梭杆菌门百分比减少;梭杆菌科百分比减少,肠杆菌科百分比增加。总体来说,添加活酵母有益生效果,比如增加微绒毛高度、增强胰蛋白酶活性、降低头肾hsp70表达,具有一定抗病能力。二、2种不同蛋白类型的基础饲料,鱼粉型饲料(饲料A)和豆粕型饲料(饲料B),饲料A中鱼粉的含量比饲料B中高;饲料A中的豆粕含量比饲料B中低;。每种加1g/kg活酵母(LY)或1g/kg热灭活酵母(HIY)或无酵母(CK),每个实验组4个重复缸。由双因素方差分析可知,添加酵母和饲料蛋白类型都能显著影响罗非鱼末重(FBW)、增重(WG)和饲料利用率(FCR)。相比饲料A型饲料,饲料B型饲料能显著增加FBW、WG和FCR。LY组能显著增加FBW、WG和FCR;而HIY仅能显著性增加WG和FBW,FCR只有稍微改善。酵母添加和饲料蛋白类型没有交互作用。饲料蛋白类型和酵母添加对罗非鱼肠道粘膜微绒毛形态有显著性影响。相比CK,LY组能显著增加微绒毛密度和长度而HIY组却不能。相比饲料A,饲料B能显著增高肠微绒毛密度和长度。且饲料蛋白类型和酵母添加之间的没有交互作用。相比CK,肠和头肾hsp70在LY表达量显著下调,而HIY有无显著性影响。相比饲料A,肠hsp70在饲料B表达量显著下调。LY组能显著降低肠tnf-α和tgf-β(饲料A中)基因表达,并能降低il-1β表达量(P=0.08)。LY和HIY能显著降低肠碱性磷酸酶AKP活性,这表示LY和HIY能有利抵抗致病菌的感染。且饲料蛋白类型与酵母添加之间没有显著的交互作用。对于肠道粘附菌群在门类水平上,添加酵母组和基础饲料组的丰度无显著变化;在属类水平上,LY中只有Deefgea spp丰度降低。非粘附菌群结果,相比饲料A,饲料B中物种丰度减少。饲料B中谱系多样性(PD whole tree)显著降低,香浓指数微降低。在属类水平上,添加酵母能显著增加乳酸乳球菌Lactococcus spp丰度。本研究表明,活酵母作为饲料添加剂具有优势,如能改善微绒毛形态和使hsp70表达下调,同样在鱼粉组中炎症相关基因的下调,这些表明在酵母分泌代谢产物在相关通路的重要性。然而,酵母分泌代谢产物的益生效益和作用模式有待进一步研究,这可能是替代抗生素的一种新型的饲料添加剂。三、本实验有4个实验组,对照组;Y1组:韩国Veterinary Pharmaceutucals公司提供含1g/kg酵母培养物(Saccharoculture,酵母培养产物中含1×107 CFU/g解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens孢子);Y2组:美国Diamond V Mills Inc.公司提供酵母培养物(塞克灵,DVAQUA®产品);Y3组:北京大北农集团公司提供肠立健包含0.2g/kg商业产品(每克产品中包含1×1010 CFU活酵母S.cerevisae和1.2×1010CFU解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens孢子)。每组3个重复,不同处理组对鲤鱼的生长相关参数没有显著性差异。肠hsp70基因相对表达量没有显著差异。肝脏hsp70表达量在Y1组有下调的趋势,Y2组中显著下调。与此相反,hsp70表达量在Y3组中显著上调。在肾脏中,hsp70表达量在Y2组中显著上调,而在Y1和Y3组中没有变化。微绒毛形态分析,Y1和Y2组肠的微绒毛长度显著增加。Y3组中前肠的微绒毛密度显著减少。微绒毛直径没有显著性差异。所有实验组有较高存活率趋势,却没有显著性差异。本实验结果表明低剂量的添加酵母培养物和解淀粉芽孢杆菌在一定程度上有利鲤鱼的生长,比如显著增加微绒毛长度,降低hsp70相对表达。然而,在此实验条件下添加活酵母和解淀粉芽孢杆菌没有获得有利于鲤鱼的生长和免疫先关的效益,所以需要更一步研究活酵母或酵母培养物以及解淀粉芽孢杆菌在水产动物方面的益生作用的研究。