研究背景卵巢上皮性癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其恶性程度高,临床症状隐蔽,缺乏相对特异性的症状,不易早期发现,病情发展迅速,直到出现腹胀腹水,或者大的腹部肿块才得以就诊,确诊时绝大多数已属晚期,预后差,病死率居妇科恶性肿瘤之首。有数据报道,2010年美国有约21880例新发病例,其死亡人数高达13850。尽管手术技巧的提高可以做到最大限度的切除肿瘤,铂类、紫衫醇类以及二线化疗药物治疗的临床应用,给患者带来了多种生机,晚期卵巢癌患者的5年生存率仍无明显提高。许多研究发现,不同组织学类型的卵巢上皮性癌具有相对独立的病因及分子生物学改变,表现为不同的基因表达谱、遗传倾向以及分子发生机制。此外,越来越多的证据表明,输卵管粘膜,尤其是输卵管伞部上皮很可能是浆液性卵巢癌的起源,然而,关于卵巢癌的确切发生起源及分子发生机制尚处于探索阶段。在临床上,人绒毛膜促性腺激素p亚单位(β-hCG)是妊娠滋养细胞肿瘤及卵巢生殖细胞肿瘤诊断及检测中敏感的肿瘤标记物之一。分子生物学研究表明人绒毛膜促性腺激素(hCG)至少有4种变体,分别由不同来源的细胞分泌且具有完全不同的生物学功能。第一种是由妊娠期合体滋养细胞分泌的hCG,是一杂合二聚体糖蛋白复合物,糖蛋白激素(glyco-protein hormone, GPH)家族中的一个成员,由一个完全相同的α亚基,和一个激素特异性的β亚基组成。α亚基与β亚基之间由疏水非公价键和离子间的相互作用连接。在妊娠期间hCG具有促进妊娠黄体分泌孕酮,维持妊娠进展的重要生理作用；第二种由合体滋养细胞分泌的高糖基化的hCG,亦为妊娠进展所必需,是一种自分泌蛋白质,作用于细胞滋养细胞,能够促进细胞生长、妊娠组织的着床以及绒毛膜癌细胞的浸润[12,13]；第三种是由多种其它来源的恶性肿瘤细胞所分泌的游离hCGβ亚基,其不与α亚基形成二聚体,以游离形式存在。该非滋养细胞来源的游离β-hCG具有促进肿瘤细胞生长及恶性转化的生理作用；第四种为垂体hCG,是女性月经周期中,由垂体前叶促性腺细胞分泌的,其功能类似于LH,能够促进卵泡成熟、初级卵母细胞的减数分裂、排卵、卵泡的黄素化以及孕激素的生物合成[15,16]近来,游离β-hCG在非妊娠滋养细胞肿瘤中的表达及作用倍受关注,膀胱及宫颈癌细胞体外实验表明,高表达的游离β-hCG在促进细胞增殖同时具有抑制肿瘤细胞凋亡的功能；在人宫颈癌细胞中沉默β-hCG的表达,能够促进凋亡；β-hCG还具有促进人乳腺上皮细胞进入有丝分裂期,预示其将有助于乳腺上皮细胞的恶性转化。有研究发现,在卵巢上皮性癌组织中不仅有β-hCG表达水平的升高,其同类受体hCGR的表达含量也增加,预示β-hCG在卵巢上皮性癌的发生、发展中发挥着重要作用。此外,相关的临床研究表明,在诸多不同来源的非妊娠滋养细胞肿瘤患者血清、尿液及肿瘤组织中β-hCG浓度升高与患者的预后相关。在膀胱癌患者中,尿液β-hCG浓度升高,预示着肿瘤侵袭性强,化疗敏感性差,临床预后差。然而,绒毛膜促性腺激素p亚单位在卵巢上皮性癌发生、发展中的功能及分子发生机制不详,无系统的相关研究。在美国M.D.Anderson肿瘤研究中心病理系“刘劲松实验室”的一项前期研究中,为探讨原发性卵巢癌中常见的转化癌基因,从10例高级别浆液性卵巢癌(High grade serous carcinoma)组织中构建了逆转录病毒cDNA表达文库。随后,用该cDNA文库感染NIH3T3细胞并接种到软琼脂上,将193个阳性克隆挑选出来进行基因测序,其中11个克隆为β-hCG基因。最近,Nowak-Markwi等也报道了8例上皮性卵巢癌中β-hCG的转录水平及分布增加。这就促使我们进一步探索β-hCG基因在卵巢上皮性癌分子发生机制中的作用。研究目的本课题通过对稳定表达β-hCG基因cDNA的永生化人卵巢表面上皮细胞T29β-hCG及T80β-hCG细胞的一系列实验研究,观察β-hCG基因对细胞增殖及细胞周期进程的影响；进一步研究β-hCG对细胞凋亡、细胞周期调控的分子机制：通过体内、外实验验证β-hCG对永生化人卵巢表面上皮细胞恶性转化方面的作用；研究人正常卵巢上皮、输卵管上皮、卵巢良、恶性上皮性肿瘤中β-hCG的表达差异。以探讨人绒毛膜促性腺激素在促进永生化人卵巢表面上皮细胞恶性转化中的作用,及其致瘤活性的分子发生机制,为卵巢上皮性癌的防治提供新的策略和方法。方法1.简介本研究中的细胞系：(1)T29和T80细胞系：是由正常人卵巢表面上皮细胞系IOSE-29和IOSE-80,依次经SV40T/t抗原和人端粒酶逆转录酶的催化亚单位(hTERT),逆转录病毒转染产生的永生化的人卵巢表面上皮细胞系。T29和T80细胞系的非致瘤性已被本实验室的前期研究证实,该细胞系在本研究中作为亲代对照组。(2) T29β-hCG和T80β-hCG细胞系：是T29和T80细胞经逆转录病毒转染β-hCG基因cDNA所产生的稳定表达β-hCG的永生化人卵巢表面上皮细胞系。该细胞系在本研究中作为实验组。2.研究方法：(1)体外实验对照研究(流式细胞仪)分析2个实验组和2个亲代对照组永生化人卵巢表面上皮细胞的凋亡率；Western blot检测4组细胞在凋亡进程中促生存蛋白Bcl- XL的表达及促凋亡蛋白Bad的表达差异。(2)体外实验对照研究(细胞增殖实验MTT)4组永生化人卵巢表面上皮细胞在培养24h、48h及60h或72h的细胞增殖差异；流式细胞仪分析各组细胞中G1期细胞、G2期细胞的百分率；Western blot检测细胞周期进程中的细胞周期相关蛋白cyclin E,cyclin D1及与其相应的细胞周期依赖性激酶CDK2、CDK4及CDK6在各组细胞中的表达差异。(3)观察4组永生化人卵巢表面上皮细胞在体外软琼脂的克隆形成率；分别将T29、T80、T29β-hCG及T80β-hCG细胞(5×106)移植于裸鼠皮下,观察其在裸鼠的成瘤率。免疫组织化学检测裸鼠肿瘤中相关蛋白的免疫反应模式及表达。(4)用组织芯片进行免疫组织化学法检测人体相关组织中β- hCG的表达及模式：病理统计分析β- hCG在正常卵巢上皮、输卵管上皮、卵巢非赘生性囊肿,卵巢良性囊腺瘤及不同级别卵巢浆液性癌组织中的表达差异；病理统计分析β-hCG在不同组织学类型的卵巢上皮性癌组织中的表达; Kaplan-Meier生存分析β-hCG的表达对卵巢上皮性癌患者总生存率及无瘤生存率的影响。结果1.流式细胞仪细胞周期分析显示,与对照组T29细胞相比较,T29β- hCG细胞的凋亡率显著下降,12.3%(T29)比2.9%(T29β- hCG),χ2=629.13,p=0.000,差异有统计学意义；与对照组T80细胞相比较,T80β-hCG细胞的凋亡率显著下降,9.2%(T80)比3.1%(T80β-hCG),χ2=322.34,p=0.000,差异有统计学意义。免疫印迹(Western blot)实验结果显示,与对照组T29及T80细胞相比较,T29β-hCG及T80β-hCG细胞中促生存蛋白Bcl- XL的表达增高,虽然未改变促凋亡蛋白Bad的总蛋白含量,却显著降低了具有促凋亡生物活性的磷酸化Bad的表达水平。2.细胞增殖实验(MTT)结果显示,与对照组T29细胞相比较,相同数量的T29β-hCG细胞分别在培养24h、48h、60h时,细胞增殖显著增加,差异有统计学意义(F=50.70,P=0.000)；与对照组T80细胞相比较,相同数量的T80β-hCG细胞分别在培养24h、48h、72h时,细胞增殖显著增加,差异有统计学意义(F=93.42,P=0.000)。流式细胞仪细胞周期分析显示,与对照组T29及T80细胞相比较,T29β-hCG及T80β-hCG细胞的G2期细胞群百分率显著增加,分别为22.6%(T29)比33.3%(T29β-hCG)(x2=27.93, v=1,P=0.000),19.7%(T80)比29.8%(T80β-hCG) (x2=27.39,v=1,P=0.000),差异有统计学意义。免疫印迹(Western blotting)实验结果显示,与对照组T29及T80细胞相比较,T29β-hCG及T80β-hCG细胞中细胞周期相关蛋白cyclin E和cyclin D1以及其相应周期蛋白依赖性激酶Cdk2、Cdk4及Cdk6的表达增高。3.软琼脂体外克隆形成实验结果显示,与对照组T29及T80细胞相比较,相同数量的T29β-hCG及T80β-hCG细胞的克隆形成数量显著增加,分别为P<0.01及P=0.01,有统计学差异。体外实验中T29β-hCG细胞的成瘤率为13/24(10只裸鼠),T80β-hCG细胞的成瘤率为6/14(7只裸鼠),经13周观察对照组T29及T80细胞的成瘤率为0/8(分别为2只裸鼠),均无肿瘤形成,P<0.01,有统计学差异。裸鼠移植瘤组织病理学检查表现为低分化上皮性癌的病理形态学改变。免疫组织化学检测裸鼠肿瘤中相关蛋白表达：①β- hCG强阳性表达于肿瘤上皮细胞胞膜及细胞浆中,并有部分向细胞外间质分泌的免疫反应模式；②肿瘤上皮细胞SV40 T抗原强阳性表达；③肿瘤组织微血管内皮细胞中CD34强阳性表达；④细胞角蛋白(cyrtokeratin)在移植瘤上皮细胞胞质中强阳性表达；⑤移植瘤上皮细胞胞核孕激素受体阳性表达、雌激素受体阴性表达。4.β- hCG在常见人卵巢上皮性癌及交界性卵巢肿瘤组织中表达升高,在正常卵巢上皮、输卵管上皮及卵巢非赘生性囊肿中不表达或低表达,差异具有统计学意义(χ2=21.89,v=5,P=0.001)；在各种常见组织学类型的卵巢上皮性癌组织中β- hCG的表达无差异,P=0.8；β- hCG在卵巢上皮性癌中的表达与患者的总生存率及无瘤生存率无相关性,P>0.05。结论1.人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)通过上调促生存蛋白的表达、下调促凋亡蛋白的表达,抑制细胞的凋亡进程。2.β-hCG的过度表达促进了永生化人卵巢表面上皮细胞的增殖,并通过诱导细胞周期相关蛋白cyclin E和cyclin D1以及其相应周期蛋白依赖性激酶Cdk2、Cdk4及Cdk6的表达增高,促进了细胞周期的进程。3.β-hCG的过度表达增强了永生化人卵巢表面上皮细胞的克隆性生长能力,并促进裸鼠移植肿瘤的形成及生长,即β-hCG的过度表达将促进永生化人卵巢表面上皮细胞恶性转化,具有类似转化癌基因的功能。4.β-hCG在常见人卵巢上皮性癌及交界性卵巢肿瘤组织中的表达高于正常卵巢上皮、输卵管上皮及卵巢非赘生性囊肿的表达；在各种常见组织学类型的卵巢上皮性癌组织中β- hCG的表达无差异,预示β- hCG在卵巢上皮性癌中的表达及调节不具有组织学类型特异性；β- hCG的表达对卵巢上皮性癌患者的总生存率及无瘤生存率无相关性,对卵巢癌的临床预后不具有预测意义。