金山醋酸乳杆菌比较基因组分析与酿醋功能评价

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金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)是乳杆菌科(Lactobacillaceae)新属,其模式菌株HSLZ-75T分离自镇江香醋醋醅。实验室前期研究发现,在我国不同地域传统固态食醋和白酒发酵过程中,金山醋酸乳杆菌均为醋醅或酒醅细菌群落中的高丰度微生物,尤其在醋酸发酵后期的高酸环境下,其丰度占比高达90%。然而,目前对金山醋酸乳杆菌的生理生化特性及其在酿造过程中的作用等方面尚缺乏了解。因此,本论文以Acetilactobacillus jinshanensis HSLZ-75T为研究对象,通过摇瓶纯培养实验,分析了 HSLZ-75T的生理生化特性,并优化了菌株培养条件;采用全基因组测序分析了HSLZ-75T的功能潜力,通过与其他酿醋细菌的比较基因组分析,解析HSLZ-75T耐酸等特征的潜在机理;进一步通过镇江香醋酿造不同阶段的原位强化实验,探究了金山醋酸乳杆菌在食醋酿造中的功能。本研究系统解析了金山醋酸乳杆菌的生长代谢特点及酿造功能,以期为其在生产中的理性应用提供理论依据。主要研究结果如下:(1)研究了不同种类酸(乙酸、乳酸、盐酸、草酸、丙酮酸和柠檬酸)和供氧条件对HSLZ-75T生长的影响,结果显示该菌株仅在乙酸调节培养基pH 3.65-4.15时可较好生长,最适pH 3.85,最适气体组成为5%CO2,10%H2和85%N2。通过单因素培养条件优化,HSLZ-75T最佳生长及产乳酸条件为:MRS培养基中添加200 g·L-1麦芽浸粉和3%(v/v)乙酸,37℃厌氧培养。在此条件下培养HSLZ-75T 3.5天,高效液相色谱检测其产乳酸 11.98±0.26 g·L-1,以及少量乙酸(2.60±0.35 g·L-1)和柠檬酸(1.93±0.21 g·L-1),并检测到21种挥发性化合物,包括苯乙醇、糠醇、辛酸、乙酸、乙酸糠酯、乙酸乙酯、苯甲醛、壬醛、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等。(2)金山醋酸乳杆菌HSLZ-75T基因组编码区长度1,616,430 bp,GC含量39.69%。分别有23个、1061个、1043个、821个基因注释到CAZyme、COG、GO、KEGG数据库。与镇江香醋酿造过程其他高丰度乳酸菌(9种)、醋酸菌(1种)进行基因组比较分析,结果表明在酿醋细菌中,HSLZ-75T基因组较小;与其余酿醋细菌共线性低;HSLZ-75T其特有基因家族功能包括钠离子运输,二磷酸硫胺素生物合成等;HSLZ-75T基因组中有关能量代谢、氨基酸转运相关基因数量最多;在酿醋细菌中与耐酸相关基因数量最多,高达25.48‰。(3)以金山醋酸乳杆菌中编码苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基的pheS基因为参考序列,设计了一对GC含量55%,Tm值59℃,扩增产物片段199 bp的金山醋酸乳杆菌特异性引物。建立的RT-qPCR方法特异性强、准确性高且通用性好,扩增效率为99.31%,检测范围为2.24 lg(copies·μL-1)-10.24 lg(copies·μL-1),成功应用于江苏、四川和山东地区的酒醅、醋醅和食醋样品中金山醋酸乳杆菌的检测。进一步采用此方法分析了镇江香醋醋酸发酵过程醋醅中金山醋酸乳杆菌的演替规律,在4-9天其数量由5.85±0.04 lg(copies·g-1干醅)迅速增加至8.72±0.09 lg(copies·g-1干醅),直到发酵结束其含量稳定在108 copies·g-1 干醅。(4)在镇江香醋不同发酵时期(前期:醋酸发酵第0天;中期:醋酸发酵第3天;后期:封醅第1天)加入9×105 copies·kg-1酿造原料的金山醋酸乳杆菌HSLZ-75T对镇江香醋酿造过程进行调控,跟踪监测酿造过程微生物含量和理化指标,检测不同酿造时间加入金山醋酸乳杆菌获得成品醋的总酸、有机酸、挥发性化合物并对成品醋感官评价。结果表明,醋酸发酵起始时强化HSLZ-75T可明显提高发酵全过程醋醅中金山醋酸乳杆菌在总细菌中的比例,体系提温速度加快,成品醋中总酸、乳酸和乙酸较对照组分别提高 10.47%(P<0.001)、76.22%(P<0.001)和 10.85%(P<0.001),乳酸占总有机酸比例从15.12%提高至22.33%,且苯乙醇、正戊酸、十四酸乙酯、乙酸苯乙酯等挥发性化合物含量较对照组显著增加。此外,前期强化工艺获得的成品醋感官品评得分最高。(5)为进一步考察金山醋酸乳杆菌在食醋酿造中的功能,选取前期强化工艺进行中试实验。金山醋酸乳杆菌可增加体系提温速度,加快葡萄糖消耗速度,缩短发酵周期,醋酸发酵终点时,醋醅总酸、乙酸、乳酸、氨基酸、挥发性化合物和酯类物质含量分别提高了 22.87%(P<0.001)、10.88%(P<0.01)、106%(P<0.001)、12.48%(P<0.001)、15.96%(P<0.05)和10.58%(P<0.05)。实验组成品醋总酸和乳酸含量分别为62.70±0.66 g·L-1 和 13.28±0.37 g·L-1,较对照组分别提高 14.28%(P<0.001)、44.77%(P<0.001),此外,乳酸在总有机酸中的比例从17.86%提高至21.54%。经OPLS-DA分析,对组间差异贡献显著(VIP≥1)的物质有15种,主要有四甲基吡嗪、乙酸乙酯、异戊酸、异丁酸3-乙酰基-2-丁酮、糠醛和3-羟基-2-丁酮。
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