研究背景高原肺水肿（High Altitude Pulmonary Edema,HAPE）是一种在高原特殊环境下发生的急性重症高原病,具有起病急、进展快、发病率高的特征,对初期进入高原人群的健康和生命安全造成严重危害。国内外对于HAPE发病率的报道有很大差异,主要是因为引起HAPE的发病因素和发病诱因有很多种,比如海拔高度、种族差异、初入高原或重返高原、进入高原的方式、职业类别和劳动强度、季节和气候变化、个体和家族易感性以及上呼吸道感染等。目前,HAPE的发病机制仍然不完全清楚,有研究者认为肺动脉压升高和血流动力学改变是HAPE发病的主要机制,也有研究者认为HAPE的发病与体内液体潴留和体液转运失调有关。此外,越来越多的研究证实炎性反应在HAPE发生中具有重要的作用,比如:1)上呼吸道感染是HAPE发生的重要诱因;2)使用地塞米松进行抗炎治疗对HAPE有明显的效果;3)HAPE患者血液样本中炎症因子的表达显著升高和血常规提示白细胞计数显著增加;4)HAPE患者尸检结果发现肺泡腔内具有很多的炎性渗出成分、纤维素沉积和透明膜形成等;5)HAPE患者的肺泡灌洗液是一种蛋白含量很高的炎性渗出液,其中包括大量的蛋白质、炎性细胞和红细胞、免疫球蛋白及补体成分等。近年来,高通量测序技术通过对基因组学、转录组学和蛋白质组学等数据的综合分析,提供了对单个疾病复杂分子机制进行系统性研究的可能,并已在肿瘤、糖尿病等疾病分子机制的研究中取得了很好的效果。HAPE的发病机制复杂,涉及到基因转录、蛋白翻译过程及其与低氧环境的相互作用,其分子基础错综复杂。从系统的角度对HAPE的发病机制进行研究能够更好地找到在其发生中扮演重要角色的基因、蛋白及其参与的关键信号通路,为HAPE发病机制的深入研究提供新的视角。本研究共分为三个部分:第一部分,比较健康对照组（Control组）和HAPE组的临床数据和血液炎症因子检测结果;使用转录组学和蛋白质组学技术对HAPE患者血液样本进行检测,筛选HAPE发生时的差异基因和蛋白质,并通过基因本体论（Gene oncology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）数据库对HAPE发生中的差异基因和蛋白质参与的重要生物学过程和关键信号通路进行富集分析,揭示HAPE发生中的关键机制。第二部分,根据转录组学和蛋白质组学联合分析结果:Toll-like receptor 4（TLR4）信号通路介导的炎症反应可能在HAPE发生中具有重要作用,使用急性低氧复合低剂量脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）复制出稳定的大鼠HAPE动物模型和炎症反应增强的肺泡巨噬细胞模型。通过基因芯片技术检测大鼠HAPE模型的肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）细胞筛选出急性低氧复合低剂量LPS后的差异表达基因,对这些差异基因进行功能注释发现其主要参与到炎症反应和免疫反应调控相关的生物学过程,并且TLR4信号通路是其中的关键信号通路。然后在肺泡巨噬细胞模型上对TLR4信号通路介导的炎症反应进行了验证。第三部分,有文献报道外周血缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的蛋白水平与HAPE发生的易感性相关,并且我们实验发现Control组TLR4的表达与血清中的LPS含量呈显著正相关,但在HAPE组两者却无显著相关性,提示在HAPE发生中可能还有其他的因素影响了TLR4信号通路的激活。在HAPE组的差异表达基因TLR4（表达上调）与HIF-1α（表达下调）呈显著负相关,提示在HAPE发生中HIF-1α与TLR4信号通路之间可能具有某些联系。因此,我们使用HIF-1α的抑制剂、激动剂、siRNA干扰序列以及过表达质粒调控肺泡巨噬细胞内的HIF-1α表达水平,从而研究HIF-1α与急性低氧复合低剂量LPS诱导的炎症反应以及TLR4信号通路之间的关系。我们通过预处理增强大鼠体内的HIF-1α表达水平,并检测预先增加体内HIF-1α表达水平后对大鼠HAPE模型肺损伤的作用。通过以上研究,揭示了HAPE发生中的关键机制,为今后预防和治疗HAPE提供有效的靶点和新的思路。研究对象和实验方法一、HAPE患者的临床资料收集、血液样本采集和组学数据检测（1）研究对象是急进高原的健康成年男性（Control组）和根据HAPE诊断标准和临床检查结果诊断出的成年男性HAPE患者（HAPE组）。（2）收集研究对象的医院病例资料、临床检查结果和血液样本。（3）进行转录组学（RNA-seq）、蛋白质组学（iTRAQ）检测和生物信息学分析。（4）酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清中的白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及白细胞介素-8（IL-8）等炎症因子、LPS含量和脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide binding protein,LBP）。（5）使用逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）验证转录组学筛选出的重要差异基因。二、大鼠HAPE动物模型的实验条件和检测指标（1）研究对象为体重200±20g的8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。（2）将大鼠随机分为4个组:（I）常氧对照组（CTL组）,（II）单纯LPS刺激组（LPS组）,（III）暴露于急性低压低氧组（HPO组）,（IV）急性低压低氧暴露复合LPS处理组（COMB组）。（3）在模拟5000m海拔高度中进行HPO组和COMB组大鼠样本的取材。（4）检测大鼠的平均肺动脉压,采集腹主动脉血行血气分析、分离血浆。收集BALF,取肺,部分用于病理形态学观察,部分用于测定肺含水量。以ELISA法检测BALF和血浆中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的变化。三、肺泡巨噬细胞模型的实验条件和检测指标（1）研究对象为大鼠肺泡巨噬细胞系（NR8383,中国科学院细胞库,中国上海）。（2）将NR8383细胞分成4组:（I）CTL组,作为正常对照;（II）LPS组,在常氧条件下用含10 ng/ml LPS的培养基培养6小时,（III）HPO组,将细胞放置于含有5%O ₂的培养箱中培养6小时,（IV）COMB组,在含有5%O ₂的培养箱中使用含10 ng/ml LPS的培养基培养6小时。（3）采用荧光素酶报告基因法检测TLR4启动子的转录活性。（4）使用TLR4抑制剂（TAK242）作用于NR8383,检测细胞内TLR4的表达变化以及细胞内和培养基中IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达变化。四、干预HIF-1α表达水平和使用HIF-1α激动剂预处理大鼠的条件和检测指标（1）使用HIF-1α的抑制剂（PX478）、HIF-1α的激动剂（DMOG）、HIF-1α的siRNA干扰序列以及HIF-1α的过表达质粒对NR8383细胞进行处理,从而干预NR8383细胞的HIF-1α蛋白表达水平。将每种处理条件相应的实验分为两个大组:空白对照组和干预HIF-1α组,而每个大组里面包含4个小组（与前面4个组的处理条件一致）。（2）检测干预HIF-1α表达后TLR4启动子、TLR4、IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达变化。（3）使用HIF-1α激动剂（DMOG）预处理大鼠,上调HIF-1α蛋白表达后再复制HAPE模型。检测平均肺动脉压,采集腹主动脉血行血气分析、分离血浆。收集BALF,取肺,部分用于病理形态学观察,部分用于测定肺含水量。以ELISA法检测BALF和血浆中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量主要结果一、TLR4信号通路介导的炎症反应参与高原肺水肿的发生1.HAPE患者炎症反应较对照组显著增强HAPE患者的主要症状有咳嗽、咳痰、呼吸困难、咳白色或者粉红色泡沫痰,主要体征为体温升高、呼吸频率加快,肺部听诊可闻及湿罗音;X线胸片可见肺部点片状或者云絮状浸润阴影。与对照组相比,HAPE患者外周血白细胞计数及血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的含量显著升高。2.HAPE患者的差异基因和蛋白质主要参与炎症反应和免疫反应调控等生物学过程转录组学的结果显示,与Control组相比,HAPE患者共有3352个基因表达出显著性差异,其中包括2112个上调基因和1240个下调基因。这些差异表达基因主要参与到免疫反应相关生物学过程;炎症反应相关生物学过程;细菌感染相关的分子调控过程;自噬相关生物学过程;氧化磷酸化相关生物学过程;以及能量代谢相关生物学过程。其中,p值最小的生物学过程是激活免疫反应,富集因子最大的生物学过程是Toll样受体信号通路的正调节,包含差异基因最多的生物学过程是免疫反应的正向调节。蛋白质组学的结果显示,与Control组相比,HAPE患者共有95个蛋白表达出显著性差异,其中包括58个上调蛋白质和37个下调蛋白质。这些差异表达蛋白质主要参与到免疫系统过程、对细菌的防御反应、细胞激活、应激反应、中性粒细胞激活、IL-8（Interleukin-8,IL-8）的产生、白细胞脱颗粒、细胞因子的产生等生物学过程。此外,反应机体的炎症活动和急性状态的重要敏感指标,如C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）和α1-酸性糖蛋白（α1-acidglycoprotein,α1AG）在HAPE患者血清中显著升高,提示急性炎症反应参与HAPE发生。3.TLR4信号通路介导的炎症反应可能在HAPE发生中具有重要的作用HAPE患者的差异基因主要参与到抗原识别相关的炎症信号通路,如Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路等;或者炎症反应相关的信号通路,如TNF信号通路和抗原处理和呈递等;也有免疫反应激活相关的信号通路,如T细胞受体信号通路、补体和凝血级联、细胞因子-细胞因子受体相互作用和细胞粘附分子（CAMs）等;还有机体抵御革兰氏阴性细菌,如结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、军团杆菌信号调节通路;以及抵御革兰氏阳性细菌,如金黄色葡萄球菌。在这些差异改变的信号通路中,差异改变最明显的通路是免疫反应或者炎症反应相关的通路,很多其他差异改变的通路也是免疫反应和炎症反应激活后的下游信号通路,并且改变较为显著的通路也包括机体对于细菌等异物的防御反应信号通路。根据每条通路的差异改变程度、富集因子和包含差异基因数量综合分析,发现Toll样受体信号通路可能在HAPE发生中具有重要的作用。HAPE患者的差异表达蛋白质主要参与Toll样受体信号通路、系统性红斑狼疮、IL-17信号通路、血管加压素调节的水重吸收、哮喘、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、急性髓性白血病、病毒致癌作用、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、程序性坏死、NOD样受体信号通路等信号通路。此外,在HAPE患者血清中的LPS含量、LBP、Pentraxin相关蛋白PTX3和钙结合蛋白S100A8（S100A8）明显增加;转录组学筛选出TLR4信号通路的重要差异基因,比如CD14、TLR4、MD2、MYD88和IRAK4的表达均显著升高,提示TLR4信号通路可能是HAPE发生中的重要信号通路。二、低氧增强TLR4信号通路介导的炎症反应可能是高原肺水肿发生的关键环节1.急性低氧复合低剂量LPS能够复制出稳定的大鼠HAPE模型与CTL组、LPS组和HPO组相比,H.E染色提示COMB组大鼠肺组织中的炎症细胞数量显著增加,肺泡间隔充盈更加明显和肺泡结构的严重破坏更加严重,肺组织湿干重比值明显增加,肺泡灌洗液的蛋白浓度也显著升高。此外,RT-PCR和基因芯片检测到COMB组炎症相关的基因,比如LBP,Cluster of Differentiation 14（CD14）,Chemokine（C-C motif）ligand 3（CCL3）,NF-kappa-B inhibitor alpha（NF-κBia）,TNF-α和IL-1β等的表达水平明显高于其他三组。ELISA检测到COMB组BALF和血浆中的炎性细胞因子水平也显著高于其他三组。此外,基因芯片检测筛选出1595个表达上调的差异基因,其中COMB组含有1489个,LPS组含有293个,HPO组含有221个;有1213个表达下调的差异基因,其中COMB组含有1171个,LPS组含有158个,提示COMB组的差异基因表达显著增多。综上所述,COMB组的大鼠出现明显的肺水肿,提示急性低氧复合低剂量LPS能够诱导出大鼠HAPE模型。2.大鼠HAPE模型的差异表达基因主要参与到炎症反应和免疫反应相关生物学过程,TLR4信号通路是关键信号通路通过GO富集分析发现大鼠HAPE模型BALF细胞的差异表达基因最主要参与免疫反应和炎症反应相关的生物学过程,比如对IL-1的反应、IL-8的正向调节、IL-6的产生、NF-κB信号传导的正调节、中性粒细胞趋化性、细胞因子和趋化因子产生、细胞粘附等。通过KEGG富集分析发现大鼠HAPE模型BALF细胞的差异表达基因主要参与Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、B细胞信号通路、T细胞信号通路以及抗原处理和呈递信号通路等信号通路。在COMB组的TLR4信号通路的相关基因,比如LBP、CD14、CCL3、CCL5以及CXCL10等表达水平明显高于其他三组;LPS引起的炎症反应相关基因,比如TNF-α,IL-1β和IL-6等的表达也显著高于其他三组,提示TLR4信号通路可能是急性低氧增强LPS介导的炎症反应中的关键信号通路。3.低氧通过激活TLR4信号通路来增加LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应与CTL组、LPS组和HPO组相比,COMB组的NR8383细胞和培养基中的炎症因子,比如TNF-α,IL-1β和IL-6的表达水平显著升高。此外,COMB组TLR4基因的mRNA和蛋白水平增加更明显,转染到COMB组的TLR4启动子活性也显著高于其他三组,提示急性低氧复合低剂量LPS能够显著增加肺泡巨噬细胞的TLR4基因以及其下游的炎症因子表达。使用TLR4的抑制剂（TAK-242）抑制NR8383的TLR4后,LPS组和COMB组TLR4的mRNA和蛋白表达被明显抑制,并且TAK-242以剂量依赖性方式降低了LPS组和COMB组的炎性因子表达。综上所述,TLR4信号通路可能是低氧使低剂量LPS诱导肺泡肺巨噬细胞中的炎症反应增强的重要枢纽。三、HIF-1α通过抑制TLR4信号通路介导的炎症反应对HAPE发生具有保护作用1.HIF-1α与TLR4的相互作用可能参与HAPE发生通过相关性分析发现,在Control组的差异基因TLR4的表达值与血清中的LPS含量呈显著正相关,但在HAPE组两者却无显著相关性,提示在HAPE发生中可能还有其他的因素影响了TLR4信号通路的激活。此外,对HAPE患者的上调基因TLR4和下调基因HIF-1α进行相关性分析发现,TLR4与HIF-1α之间存在显著的负相关,提示在HAPE发生中表达下调的HIF-1α与表达上调的TLR4之间可能具有某些联系。2.HIF-1α通过调节TLR4的表达来调节肺泡巨噬细胞的炎症反应首先,荧光素酶报告基因实验发现使用PX478和siRNA干扰序列降低NR8383的HIF-1α水平能够增强TLR4启动子活性;反之,使用DMOG和HIF-1α过表达质粒增加NR8383的HIF-1α水平能够抑制TLR4启动子活性。其次,使用PX478和siRNA干扰序列降低NR8383的HIF-1α水平能够增强TLR4转录和翻译水平,并且使细胞的TNF-α表达增强;反之,使用DMOG和HIF-1α过表达质粒增加NR8383的HIF-1α水平能够抑制TLR4的转录和翻译水平,并且细胞的TNF-α表达减弱。综上所述,HIF-1α通过调节TLR4的表达来调节肺泡巨噬细胞的炎症反应。3.预先增加大鼠的HIF-1α能够缓解急性低氧复合低剂量LPS介导的炎症反应对肺组织的损伤与未处理的COMB组相比,H.E染色结果显示使用DMOG预处理后的COMB组的大鼠肺泡腔中炎性细胞的数量和隔膜充血水平显著降低,肺组织湿干重比也显著降低,动脉血氧饱和度显著升高。此外,DMOG预处理后的COMB组的大鼠血浆中的炎症因子,比如TNF-α,IL-1β和IL-6的表达水平显著降低。总之,预先增加大鼠体内的HIF-1α后能够缓解急性低氧复合低剂量LPS介导的炎症反应对肺组织的损伤。结论（1）HAPE患者炎症反应较对照组显著增强。（2）HAPE患者差异表达基因和蛋白质的功能主要富集于炎症反应和免疫反应调控等生物学过程,其中以TLR4信号通路的差异表达尤为显著。（3）急性低氧复合低剂量LPS能够复制出稳定的大鼠HAPE模型,大鼠肺泡灌洗液细胞的差异表达基因主要参与到炎症反应和免疫反应相关功能,并且TLR4信号通路是关键信号通路。（4）低氧可通过TLR4信号通路显著增强LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。（5）HIF-1α通过调节TLR4的表达来调节肺泡巨噬细胞的炎症反应;上调HIF-1α可显著抑制急性低氧复合低剂量LPS介导的炎症反应和肺组织损伤。（6）TLR4信号通路介导的炎症反应增强是HAPE发生的重要机制,HIF-1α可调控TLR4信号通路,调控HIF-1α/TLR4信号通路可能是防治HAPE的一种全新策略。