黑龙江地区牛奶和牛肉总产量分别占全国总量的13.58%和7.27%,是保障国家牛奶牛肉供给安全的“主力军”。黑龙江地区因地理环境和气候等疾病生态学因素导致牛腹泻病频繁高发,成为危害奶牛和肉牛健康的一种最常见疾病,严重威胁食品安全、生物安全以及人类健康,也影响乳肉供给安全。病原-宿主-环境三个疾病生态学因素及其他们之间的相互作用是牛腹泻病发生的主要病因。当前,患腹泻病牛肠道病毒组和细菌组信息缺乏,导致黑龙江地区牛腹泻病频繁发生的疾病生态学本底不清、机制不明,已经成为制约黑龙江地区牛腹泻病有效防控的关键科学问题,也是世界范围内牛腹泻病综合防控的一个共性科学难题。为了揭示黑龙江地区腹泻牛肠道微生物组及其特征、挖掘牛腹泻病发生的关键疾病生态学风险因素,本研究在黑龙江地区针对58个牛场（34个奶牛场、24个肉牛场）的74 000头牛群体（奶牛68 000头、肉牛6 000头）,采集了处于不同疾病生态学背景下患腹泻病牛和健康牛粪便样品1 120份（腹泻样品1 016份、健康样品104份）,利用宏基因组技术对1 120份牛粪便样品的病毒组和细菌组进行了鉴定,分析鉴定的病毒组和细菌组组成与特征以及重要病原的流行情况、混合感染、协同致病、遗传演化、跨种传播等病原学特征,挖掘病毒和细菌与宿主因素（临床状态、牛类型、牛年龄）以及环境因素（养殖模式、地理位置）在牛腹泻病发生中的关联性及其协同致病潜在模式,明晰牛腹泻病疾病的关键风险因素。进一步,通过对牛腹泻相关病毒的分离鉴定、致病性试验以及感染细胞转录组差异基因分析,揭示牛腹泻相关病毒的遗传演化和致病性以及不同基因型牛轮状病毒感染细胞的天然免疫调控相关基因共性表达谱特征。1.牛粪便样品病毒组和细菌组鉴定及其疾病风险因素关联性分析:本研究利用宏基因组技术对在黑龙江地区58个牛场（34个奶牛场、24个肉牛场）、74 000头牛群体（奶牛68 000头、肉牛6 000头）中随机采集的处于不同疾病生态学背景下牛粪便样品1 120份（腹泻样品1 016份、健康样品104份）进行了病毒组和细菌组鉴定,累计鉴定了39个病毒科（110种病毒）、39个细菌门（1 011个细菌属）、322个病毒全基因组序列,腹泻牛样品病毒种类和细菌属数量分别为1～23个（6.97个/样品）和120～438个（197.46个/样品）,健康牛样品病毒种类和细菌属数量分别为6～21个（10.50个/样品）和107～268个（190.30个/样品）。腹泻牛粪便病毒组和细菌组的组成、多样性以及病毒和细菌的丰度及其在不同的宿主因素和环境因素背景下呈现出不同程度变化。在腹泻牛中,16种病毒和17种细菌的丰度与宿主因素（临床状态、牛类型、牛年龄）或环境因素（养殖模式、地理位置）呈现显著的关联性（P＜0.05）;12对病毒与病毒之间、96对细菌与细菌之间、22对细菌与病毒之间存在着显著相互协同作用（P＜0.05）。SMB53、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、费克蓝姆菌属（Facklamia）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）和束毛球菌属（Trichococcus）丰度与牛的健康状态呈现显著的相关性（P＜0.05）。该结果揭示,黑龙江地区腹泻牛粪便病毒组和细菌组呈现多样性,与腹泻牛宿主因素和环境因素呈现显著的相关性。2.宏基因组鉴定的10种常见牛肠道病毒确证及其疾病风险因素关联性分析:为进一步确证宏基因组学的信息及关联因素,对10种常见的牛肠道病毒进行了回溯性检测,并进行了感染相关性分析。利用RT-PCR对黑龙江地区1 120份牛粪便样品中牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛肠道病毒、牛嵴病毒、牛星状病毒、牛环曲病毒、牛诺如病毒、牛纽布病毒、牛小核糖核酸病毒和牛病毒性腹泻病毒等10种常见牛肠道病毒进行了回溯性检测,结果显示,10种肠道病毒阳性率为1.61%～12.05%,其中,腹泻样品中阳性率为1.77%～12.30%,健康样品中阳性率为0.00%～9.62%。在1 016份腹泻粪便样本中,16.54%（168/1 016）的样本具有至少两种病毒。牛轮状病毒和牛冠状病毒感染与腹泻显著相关（P＜0.05）;牛环曲病毒、牛小核糖核酸病毒、牛冠状病毒和牛肠道病毒感染与牛类型显著相关（P＜0.05）,牛星状病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒感染与牛年龄显著相关（P＜0.05）;牛环曲病毒、牛嵴病毒、牛纽布病毒、牛小核糖核酸病毒、牛星状病毒、牛冠状病毒和牛肠道病毒感染与养殖模式显著相关（P＜0.05）;牛星状病毒、牛冠状病毒、牛嵴病毒和牛纽布病毒感染与经度显著相关（P＜0.05）;牛纽布病毒和牛诺如病毒感染与纬度显著相关（P＜0.05）。基于全基因组进化分析揭示,10种肠道病毒均具有遗传多样性,发现牛嵴病毒一个新基因型BKV5/2021/CHN株,牛嵴病毒、牛星状病毒、牛肠道病毒和Rep蛋白编码的单链环状DNA病毒存在跨物种共进化,并首次在中国的奶牛和肉牛中发现牛匈牙利病毒。该结果揭示了腹泻牛10种肠道病毒感染情况,并进行了关联性分析,腹泻病生态学风险因素的统计分析显示了与病毒组学鉴定结果的一致性。3.牛腹泻相关病毒分离鉴定:为确定本研究鉴定病毒的致病性,本研究对鉴定的牛腹泻相关病毒进行了分离鉴定及致病性试验。通过对病毒易感细胞接种,未成功分离得到牛冠状病毒,但成功分离获得了6株牛轮状病毒,分别命名为BRV J16、BRV B15、BRV C4、BRV J7、BRV J13和BRV HH5。分离毒株均能引起显著的致细胞病变效应,电镜观察显示6株牛轮状病毒感染的M A-104细胞上清液中均存在车轮状病毒样颗粒,其直径约为80 nm。利用针对牛轮状病毒VP6基因的RT-PCR扩增获得预期大小DNA片段。基于抗牛轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光试验验证均显示阳性荧光信号。全基因组测序结果显示6株牛轮状病毒基因型分别为G10-P[11]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E2-H3（BRV J16）,G10-P[11]-I2-R2-C2-M2-A11-N2-T6-E2-H3（BRV C4）,G6-P[1]-I2-R2-C2-M2-A11-N2-T6-E2-H3（BRV B15）,G6-P[5]-I2-R2-C2-M2-A11-N2-T6-E2-H3（BRV J7）,G6-P[5]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E2-H3（BRV J13）,G6-P[5]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E2-H3（BRV HH5）,11个基因片段组成均为牛轮状病毒、人轮状病毒和羊轮状病毒的重配毒株。选择BRV J16、BRV B15和BRV J7株进行乳鼠致病性试验,结果显示,牛轮状病毒感染48 h后乳鼠均表现出轻微的腹泻症状,组织病理学分析表明,牛轮状病毒感染乳鼠的小肠绒毛脱落,荧光定量检测分析显示,感染乳鼠小肠中能够检测到牛轮状病毒基因。该结果揭示了牛轮状病毒在黑龙江地区的遗传演化,发现黑龙江地区3种主要流行基因型G10-P[11]、G6-P[1]和G6-P[5]牛轮状病毒毒株对乳鼠均具有致病性。4.不同基因型牛轮状病毒感染MA-104细胞转录组学测定:为进一步揭示不同基因型牛轮状病毒感染MA-104细胞基因表达谱特征,利用BRV J16（G10-P[11]）,BRV B15（G6-P[1]）,BRV J7（G6-P[5]）3个基因型牛轮状病毒感染MA-104细胞,并在感染后2 h、8 h和24 h进行转录组学变化差异分析。结果显示,3种基因型牛轮状病毒感染MA-104细胞2 h、8 h和24 h后共同的差异表达基因分别为7个、239个和9个,不同基因型牛轮状病毒共同的差异表达基因均一致表现为基因显著上调或下调。共同差异表达基因的GO富集分析和KEGG pathway富集分析结果表明,3种基因型牛轮状病毒感染细胞2 h、8 h和24 h后共同差异表达基因主要参与与核（nucleus）和膜的组成部分（integral component of membrane）等有关的细胞成分,锌离子结合（zinc ion binding）和蛋白质结合（protein binding）等有关的分子功能,主要富集在参与病毒性传染病（infectious disease:viral）和免疫系统（immune system）等信号通路;进一步分析表明,共同差异表达基因中引起宿主天然免疫的基因TLR5、MAPK13、DDX3X、FBXO11等表达上调,而一些拮抗宿主天然免疫和促进病毒入侵的基因RNF38、Abl2、NLRC3、AGO2、EGFR和ENPP1等也显著变化。RT-q PCR验证共同差异表达基因的表达趋势同转录组测序所获得的差异表达基因的鉴定结果一致。该结果揭示了3种主要流行基因型G10-P[11]、G6-P[1]和G6-P[5]基因型牛轮状病毒感染细胞后,均能介导天然免疫调控基因TLR5、MAPK13和RNF38显著上调。本研究揭示了病原、宿主和环境三者在牛腹泻病发生过程中的相互关系,明确了牛腹泻病的发生与病毒和细菌组成以及宿主因素和环境因素具有显著相关性,揭示了不同基因型牛轮状病毒介导细胞天然免疫调控相关基因共性的表达谱特征,为牛腹泻病综合防控提供了全新的视角。