【摘 要】
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目的:探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）的毒力因子通过食管癌细胞的受体分子——溶质运载家族蛋白7成员11（solute cartier family 7 member 11,SLC7A11,xCT）调节食管鳞癌细胞谷氨酰胺代谢的机制研究。通过寻找P.gingivalis入侵宿主食管癌细胞的受体分子作用靶点,为P.gingivalis阳性
【基金项目】
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国家自然科学基金-面上项目（项目编号:82073029）；
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目的:探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）的毒力因子通过食管癌细胞的受体分子——溶质运载家族蛋白7成员11（solute cartier family 7 member 11,SLC7A11,xCT）调节食管鳞癌细胞谷氨酰胺代谢的机制研究。通过寻找P.gingivalis入侵宿主食管癌细胞的受体分子作用靶点,为P.gingivalis阳性感染的食管癌患者提供相关病因学和防治策略的理论依据。方法:1.通过CRISPR/Cas9技术将人类全基因组敲除文库Ge CKOv2 libraries B库质粒的慢病毒感染食管癌细胞系,对细胞基因进行全基因组敲除。识别并筛选出食管鳞癌细胞感染P.gingivalis后受到影响的细胞表面受体分子,即P.gingivalis感染ESCC所需的宿主受体分子。2.构建xCT和P.gingivalis的毒力因子FimA蛋白的过表达质粒,根据实验需要将质粒共转染至HEK293T细胞,并通过Western-blot验证其过表达情况。运用免疫共沉淀技术、Nano Bi T?活细胞实时蛋白相互作用实验及免疫细胞荧光实验探索P.gingivalis的毒力因子FimA蛋白和受体分子xCT之间的相互作用关系。3.利用CRISPR/Cas9技术构建xCT基因全身敲除的基因编辑小鼠。对xCT基因敲除小鼠和野生型C57BL/6J小鼠进行分组,并分别给予连续口腔灌注P.gingivalis,或PBS作为对照,剥离小鼠食管组织进行石蜡包埋。采用RNAscope?原位杂交技术对小鼠食管组织石蜡切片检测,统计各组小鼠食管黏膜中P.gingivalis的载菌量。4.采用qRT-PCR检测基因敲除小鼠和野生型小鼠体内谷氨酰胺合成酶GLS1的含量变化,以及在P.gingivalis感染条件下,干扰xCT对食管癌细胞内谷氨酰胺合成酶GLS1表达的影响。免疫组化方法检测50个食管癌组织蜡块中,GLS1的表达与P.gingivalis的表达,并分析GLS1与P.gingivalis丰度的相关性。使用还原型/氧化型谷胱甘肽试剂盒（GSH/GSSG试剂盒）检测P.gingivalis感染前后ESCC中GSH/GSSG的比率来判断其谷氨酰胺代谢水平。结果:1.通过人类全基因组Ge CKOv2 libraries B库筛选和高通量全基因组测序分析结果显示,与未感染P.gingivalis的对照组相比,感染P.gingivalis的样品中差异最显著的为xCT,ANPEP,ACE2,PIK3C3和TMEM41B;经细胞活力测定结果分析表明,在富集基因中,当干扰xCT时,对细胞活力降低最显著。细胞功能实验结果显示:P.gingivalis阳性的ESCC细胞中抑制或干扰xCT组的细胞迁移、侵袭能力明显低于未干扰组。2.免疫沉淀、Nano Bi T?活细胞实时蛋白相互作用实验及免疫细胞荧光实验等体外实验结果表明,xCT与P.gingivalis毒力因子鞭毛FimA蛋白可直接结合并相互作用;3.构建xCT基因全身敲除小鼠,其体内实验及P.gingivalis的原位杂交结果表明,xCT基因全身敲除小鼠食管上皮中P.gingivalis载菌量显著低于野生型小鼠;4.qRT-PCR检测结果表明与对照组相比,基因敲除小鼠给予P.gingivalis灌注后其谷氨酰胺合成酶GLS1降低;而野生型小鼠给予P.gingivalis灌注后其GLS1增高。感染P.gingivalis后食管癌细胞的GLS1显著高于未感染组,当干扰xCT时,与对照组相比GLS1的表达水平显著增高。免疫组化方法发现50块ESCC组织中,GLS1的表达与P.gingivalis感染呈正相关。还原型/氧化型谷胱甘肽测定结果显示,与未感染P.gingivalis组相比,感染组中GSH/GSSG比率显著增高,差异具有统计学意义,即细菌感染组细胞的谷氨酰胺代谢增强。结论:1.xCT是P.gingivalis入侵食管癌细胞的主要受体分子之一;2.P.gingivalis的毒力因子FimA可与宿主细胞表面受体分子xCT发生互作;3.P.gingivalis感染食管癌细胞后增强细胞的谷氨酰胺代谢;4.抑制xCT可能是预防或治疗P.gingivalis阳性食管癌的潜在靶点,为食管癌的病因学和防治策略的提供新的理论依据。
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