ABA对丹参中丹参酮及丹酚酸合成代谢调控的研究

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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)作为中国传统中药被广泛应用于治疗心脑血管疾病以及炎症。其有效活性成分主要包括两类:脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的丹酚酸类化合物。这两类有效成分都具备多种药用功能。本实验首先研究了ABA诱导子处理野生丹参植株前后,丹参酮,丹酚酸生物合成途径相关酶基因的表达与丹参酮类,丹酚酸类产物含量以及产物的抗肿瘤与抗氧化活性之间的相关性。同时克隆丹参中ABA受体SmPYL基因的开放阅读框,将PYL基因遗传转化到丹参毛状根中。获得阳性转基因毛状根株系,由此为基因工程技术手段提高丹参酮及丹酚酸类化合物的产量奠定基础。最后研究了丹参酮对乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的抗肿瘤分子机制,为今后丹参酮类药物对乳腺癌抗癌作用提供一定的理论依据。所取得的研究成果如下:
  1ABA能够共同调节丹参酮合成途径中的MEP(2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸)与MVA(甲羟戊酸)途径。此外,ABA能够促进迷迭香酸合成途径中的Sm PAL1(位于苯丙氨酸支路途径)以及Sm TAT(位于酪氨酸支路途径)的基因表达量显著提高。
  2AB A能够促进野生丹参根中丹参酮和丹酚酸含量的提高。其中,总丹参酮含量在ABA诱导9天后提高最为显著为13.26mg/g,是ABA诱导0天对照(4.64mg/g)的2.86倍。总酚酸类化合物含量在ABA诱导丹参植株6天后也达到了最高值25.55mg/g,是ABA诱导0天对照(12.36mg/g)的2.06倍。
  3利用DPPH·法和ABTS+·法对总丹参酮含量最高的ABA诱导9天后的野生丹参植株根粗提物,总丹酚酸含量最高的AB A诱导6天后的野生丹参植株根粗提物,以及AB A诱导0天的野生丹参植株根粗提物,进行了抗氧化活性分析,由实验结果可知,在ABA诱导野生丹参植株根的粗提物中,总丹酚酸含量最高的粗提物在DPPH·法和ABTS+·法抗氧化活性分析中都表现出了最强的自由基清除能力。
  4利用MTT法,对总丹参酮含量最高的ABA诱导9天后的野生丹参植株根粗提物,以及ABA诱导0天的野生丹参植株根粗提物,进行了抗肿瘤活性分析。结果表明,ABA诱导9天后的野生丹参植株根粗提物对MDA-MB-231人类乳腺癌细胞,K562白血病细胞和HO卵巢癌细胞三种细胞有更强的肿瘤杀伤性,即当丹参酮含量越高,抗肿瘤活性越强。
  5研究了二氢丹参酮对乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的抗肿瘤分子机制。实验表明,二氢丹参酮可能通过抑制乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中蛋白酶体的活性(HIF-1α表达量提高)而引起内质网压,之后促进GRP78/Bip和CHOP/GADD153表达量的升高,最终导致细胞凋亡。
  6克隆SmPYL基因表达框,并构建植物表达载pCAMBIA2300+SmPYL,用农杆菌介导法转化丹参叶片,结果获得SmPYL阳性毛状根克隆17个,阳性率为28.33%。
  7对SmPYL基因在丹参各个组织(主根、须根、叶、叶柄、茎、花萼、花蕾、花、嫩种子、老种子)中的表达情况进行分析,结果表明,SmPYL基因在丹参植株的须根中的表达量最高,其次在主根中表达较高,而在花蕾中的表达量最低。此外,实验还证明了SmPYL基因的表达量可受ABA调控。当丹参植株受ABA诱导时,SmPYL基因的表达量有了较明显的提高。
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