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背景和目的肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球最常见的致命性肿瘤之一,慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染已被证明是HCC的主要危险因素。研究表明HBV X（HBX）基因在肝癌的发生发展中发挥重要作用。近年来越来越多的研究显示,HBX基因序列中广泛存在核苷酸点突变和序列缺失突变,并且这些突变与肝癌进程密切相关。然而,截至目前尚不明确HBX突变在HCC发生发展中的作用与机制。近期有研究报道,内质网应激和细胞自噬可能参与HCC的发生发展;同时有研究初步显示,内质网应激和细胞自噬可能受到HBX的调控。但是,HBX突变是否通过对内质网应激和自噬的调节参与肝癌进程尚属未知。因此,本研究旨在分析HBV相关肝癌组织中HBX突变的特征,并在此基础上研究HBX突变对肝癌Hep G2细胞生物学功能的影响,进一步探索内质网应激/自噬在HBX突变介导的HCC中的可能作用及机制。方法1.收集2015年1月至2016年12月期间广西医科大学附属肿瘤医院接受手术治疗的HBV相关HCC患者的肝癌组织及邻近癌旁组织各61例。通过巢式PCR法扩增HBX基因,然后应用Sanger测序法对扩增产物进行序列测定。最后以NCBI数据库中的HBX基因序列NC003977.1为参考序列,通过Mutation Surveyor（V4.0.8）软件对获得的HBX基因序列进行分析。2.根据第一部分的研究结果,选取目的HBX突变序列进行人工合成,然后将其克隆入真核表达载体GV362。紧接着通过脂质体转染的方法将HBX-GV362重组载体导入肝癌Hep G2细胞,同时以GV362空白载体作为对照。最后通过G418筛选稳定表达HBX蛋白的Hep G2细胞,并以Western blot方法进行验证。3.通过CCK-8实验检测细胞增殖,通过平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,通过流式细胞术检测细胞周期与凋亡,通过划痕实验检测细胞迁移,进而分析HBX突变对肝癌Hep G2细胞生物学功能的影响。4.通过Western blot方法检测PDI、Grp78以及CHOP蛋白的表达水平,初步分析HBX突变与肝癌Hep G2细胞内质网应激的关系;同时通过Western blot方法检测P62、LC3以及Beclin 1的表达水平,初步分析HBX突变与肝癌Hep G2细胞自噬的关系。分别以内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）与诱导剂衣霉素（Tunicamycin,TM）处理稳定转染HBX-GV362重组载体的细胞,然后通过Western blot方法检测细胞中P62、LC3、Beclin 1蛋白表达水平的变化,同时通过流式细胞术检测细胞周期与凋亡的变化。同样,分别以自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）与诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）处理稳定转染HBX-GV362重组载体的细胞,然后通过Western blot方法检测细胞中PDI、Grp78、CHOP蛋白表达水平的变化,同时通过流式细胞术检测细胞周期与凋亡的变化。综上分析HBX突变是否通过内质网应激和细胞自噬参与肝癌Hep G2细胞生物学功能的调控,同时初步探索内质网应激与细胞自噬之间是否存在调控关系。5.统计学分析。采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计学分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,两组样本间均数的比较采用t检验,多组样本间均数的比较采用方差分析;计数资料以率或构成比（%）表示,组间比较采用卡方（x2）分析。结果均以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.本部分研究共获得122条HBX基因序列,其中广泛存在核苷酸点突变与序列缺失突变,详细结果如下:（1）癌与癌旁组织间HBX缺失突变的分布无统计学差异（P＞0.05）,并且HBX羧基端缺失突变在癌与癌旁组织间的分布亦无统计学差异（P＞0.05）。但同时结果显示,HBX基因羧基端缺失长度介于12-270 bp之间,且癌组织中的缺失长度明显大于癌旁组织（33.10±71.45 vs.12.64±23.82,P＜0.05）。（2）癌与癌旁组织中核苷酸点突变的数量分别为260个和190个。其中共发现62个热点突变,但是癌与癌旁组织间有差异的热点突变只有10个,即C1653T、C1655T、C1673G、T1719G/G1721A、T1753V（C/A）、A1762T、G1764A、A1762T/G1764A、A1775G以及T1800C。除A1775G突变外,其余突变均是癌组织中的检出率高于癌旁组织（P＜0.05）。2.根据第一部分的研究结果,我们选取了8种HBX基因突变序列,将其分别命名为:HBX-C1479A/A1499G、HBX-T1719G/G1721A、HBXT1753A/A1762T/G1764A/T1768A、HBX-A1762T/G1764A、HBX-del 54、HBX-del 54/mt、HBX-del 105、HBX-del 105/mt。同时,我们亦纳入了HBX野生基因序列（命名为HBX-wt）。通过分子克隆与脂质体转染的方法,我们成功构建了稳定表达HBX蛋白的肝癌Hep G2细胞系。通过Western blot证实了HBX基因转染组细胞中蛋白的表达,而GV362空白载体转染组细胞与未转染组细胞中均未检测到HBX蛋白的表达。3.CCK-8实验结果显示,转染HBX基因序列后肝癌Hep G2细胞的增殖能力明显增强（P＜0.05）;除HBX-C1479A/A1499G与HBXT1719G/G1721A突变转染组细胞外,其余各突变转染组细胞的增殖能力均明显强于HBX野生基因HBX-wt转染组细胞（P＜0.05）,并且HBXT1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del 105/mt突变转染组细胞的增殖能力最强（P＜0.05）。平板克隆形成实验的结果与CCK-8实验结果一致。根据流式细胞周期的实验结果,转染HBX基因后肝癌Hep G2细胞中（G2+S）期比例明显增加（P＜0.05）,G1期比例明显减少（P＜0.05）;除HBXC1479A/A1499G与HBX-T1719G/G1721A突变转染组细胞外,其余各突变转染组细胞中（G2+S）期比例均明显高于HBX野生基因HBX-wt转染组细胞（P＜0.05）,同时G1期比例均明显低于HBX野生基因HBX-wt转染组细胞（P＜0.05）,并且HBX-T1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del105/mt两种突变转染组细胞周期分布的变化最为显著（P＜0.05）。根据流式细胞凋亡的实验结果,转染HBX野生基因后肝癌Hep G2细胞的凋亡率无明显变化（P＞0.05）,而转染HBX突变基因后肝癌Hep G2细胞的凋亡率降低（P＜0.05）,其中HBX-T1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del 105/mt两种突变转染组细胞的凋亡率最低（P＜0.05）。划痕实验结果显示,转染HBX野生基因HBX-wt及突变基因HBX-C1479A/A1499G与HBXT1719G/G1721A后肝癌Hep G2细胞的划痕愈合指数无明显变化（P＞0.05）,而转染其它HBX突变基因后肝癌Hep G2细胞的的划痕愈合指数明显升高（P＜0.05）,其中HBX-T1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del 105/mt两种突变转染组细胞的划痕愈合指数最高（P＜0.05）。4.转染HBX突变后肝癌Hep G2细胞三种内质网应激标志蛋白PDI、Grp78及CHOP的表达明显增加;而转染HBX野生基因HBX-wt后肝癌Hep G2细胞三种内质网应激标志蛋白的表达均无明显变化。转染HBX突变后肝癌Hep G2细胞自噬标志蛋白Beclin 1、LC3的表达以及LC3-II与LC3-I的比例均明显增加,自噬标志蛋白P62的表达均明显降低;而转染HBX野生基因HBX-wt后细胞自噬标志蛋白的表达均无明显变化。然后我们选取HBX突变基因HBX-T1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del 54/mt进行深入研究。结果显示:（1）当应用内质网应激抑制剂4-PBA抑制细胞内质网应激后,细胞中Beclin 1蛋白的表达降低,P62蛋白的表达增高,LC3-II与LC3-I的比例降低;同时细胞中G1期比例明显升高（P＜0.05）、（G2+S）期比例明显降低（P＜0.05）、凋亡率明显升高（P＜0.05）。而当应用内质网应激诱导剂TM诱导细胞内质网应激后表现出与上述截然相反的结果。（2）无论是以自噬抑制剂CQ抑制自噬发生还是以自噬诱导剂RAPA诱导自噬发生,细胞中内质网应激标志蛋白的表达均无明显变化。但是以CQ处理细胞后能够明显增加G1期细胞的比例（P＜0.05）,降低（G2+S）期细胞的比例,升高细胞的凋亡率（P＜0.05）;反之,以RAPA处理细胞后能够明显减少G1期细胞的比例（P＜0.05）,增加（G2+S）期细胞的比例,降低细胞的凋亡率（P＜0.05）。结论1.尽管HBX基因序列中存在大量核苷酸点突变和序列缺失突变,但是与HCC相关的突变只占极少数,本研究表明C1653T、C1655T、C1673G、T1719G/G1721A、T1753V（C/A）、A1762T、G1764A、A1762T/G1764A、A1775G以及T1800C突变可能与肝癌相关。2.HBX基因突变能够促进肝癌Hep G2细胞增殖,抑制其凋亡,并促进其迁移。此外,除HBX-C1479A/A1499G和HBX-T1719G/G1721A两种突变外,其余HBX突变对肝癌Hep G2细胞生物学功能的影响强于HBX野生基因,并且HBX-T1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del 105/mt两种突变对肝癌Hep G2细胞生物学功能的影响最显著。3.HBX突变能够诱导细胞内质网应激反应与细胞自噬的发生,且HBXT1753A/A1762T/G1764A/T1768A与HBX-del 105/mt两种突变能够通过诱导细胞内质网应激反应而诱导细胞自噬的发生,进而促进肝癌Hep G2细胞周期进程并抑制细胞凋亡,这可能是HBV相关肝癌发生发展的机制之一。