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作为“高原之舟”,牦牛是唯一适应青藏高原高寒、低氧、枯草期漫长等极端生境的大型哺乳动物(海拔4,000米以上)。脑是对环境氧最敏感的器官,其重量仅为总体重的2-5%,但消耗的氧却高达总耗氧量的20%。p53作为经典的肿瘤抑制因子,在调节细胞的增殖、生长、DNA修复、细胞死亡、细胞生存、衰老、分化、干细胞重编程和代谢等方面发挥着重要作用。但到目前为止,在国内外尚未见到任何有关牦牛脑p53相关的研究报道。因此,为了探讨青藏高原动物对其极端低氧生境适应的分子机理,本论文以牦牛脑为研究对象,以p53的结构、表达及其功能特征为突破口,运用基因克隆、载体构建、细胞培养、基因过表达、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光和Western blotting等技术,系统分析了牦牛脑p53对其极端低氧生境适应的分子机理。结果1.基因克隆和生物信息学分析结果表明,牦牛p53 CDS全长序列与黄牛的相同,均长1161bp,编码386个氨基酸;其碱基序列同源性为99.74%,仅存在一个氨基酸位点的差异,即牦牛的第106位氨基酸为组氨酸,而黄牛的为谷氨酰胺。牦牛p53氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、大鼠及小鼠的同源性均较高,分别为99%、95%、74%和73%,且牦牛和藏羚羊同一位点氨基酸均为组氨酸,而黄牛、大鼠和小鼠的均为谷氨酰胺。2.qRT-PCR定量分析表明,牦牛大脑皮质和海马中p53 mRNA分别是黄牛的1.04和1.18倍。免疫组化及免疫荧光结果表明牦牛、黄牛的大脑皮质和海马中均有p53蛋白表达,在大脑皮质中p53免疫阳性反应产物主要在神经元和神经胶质细胞胞浆中,在海马组织中,p53主要表达在锥体细胞细胞质中。免疫组化和Western blotting定量分析表明p53蛋白在牦牛大脑皮质和海马中的表达量均高于黄牛的(P大脑皮质<0.05;P海马>0.05)。3.基因调控网络建模分析表明,在低氧胁迫下,p53被激活并通过调控AMPK、mTOR和p21等多个靶基因参与调节多条信号通路,最终调控细胞蛋白合成、生长自噬、凋亡、血管生成和糖代谢等生命进程。4.p53调控相关基因表达分析,1)qRT-PCR定量分析表明,在牦牛大脑皮质中,p53调控相关基因GLUT1、GLUT3、TIGAR、PGAM1、HK2、SCO2、G6PD、HIF-1α、ET-1、VEGF、AMPK和mTOR mRNA的表达分别是黄牛的0.73、1.20、1.03、1.18、0.70、0.49、0.41、0.25、0.75、3、1.25和0.75倍。2)免疫组化和免疫荧光定位和半定量分析表明,牦牛和黄牛大脑皮质及海马中VEGF、ET-1、mTOR、AMPK和HIF-1α蛋白的分布特征基本相同,而免疫阳性产物的分布面积和累积光密度存在统计学差异。牦牛大脑皮质及海马中VEGF和ET-1免疫阳性产物的IOD值均高于黄牛的(P大脑皮质<0.05,P海马<0.001);牦牛大脑皮质及海马中HIF-1α免疫阳性产物的IOD值均高于黄牛的(P大脑皮质<0.05,P海马<0.01);牦牛大脑皮质中mTOR和AMPK免疫阳性产物IOD值高于黄牛(PmTOR<0.05,PAMPK<0.01),海马组织中无统计学差别。5.功能试验分析表明,在常氧状态下,牦牛p53的过表达与黄牛的相似均能下调HIF-1α蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax值;低氧状态下,Bcl-2/Bax的比值较常氧状态下的下降趋势更加明显,但牦牛的较黄牛的下降趋势小。结论1.在高原低氧适应中,p53全长CDS第106位独特的氨基酸结构特征(牦牛和藏羚羊p53第106位均为组氨酸,而黄牛、人和小鼠的均为谷氨酰胺)是牦牛脑细胞对其低氧生境适应的重要机制之一,但其具体的功能特征有待深层次探究。2.在高原低氧适应中,p53的高表达特征(牦牛脑p53 mRNA和蛋白的表达水平均高于低海拔物种黄牛的)是牦牛脑细胞对其低氧生境适应的重要机制之一,但其具体的调控机理有待深层次探究。3.在高原低氧适应中,p53可能是通过自身的高表达降低Bcl-2/Bax值抵抗低氧诱导的细胞凋亡,维持牦牛脑细胞的正常功能;p53可能通过自身的高表达抑制SCO2和G6PD的表达水平降低牦牛脑细胞的糖代谢水平,维持其低氧胁迫下正常的糖代谢水平;p53可能是通过p53-Akt-mTOR信号通路维持牦牛脑细胞正常的蛋白合成和细胞生长。但其上述具体的调控机理有待深层次探究。