研究背景:目前,随着人类科技的进步使得生活质量提高,人类寿命得以延长,但是这也带来了人口老龄化这一新问题。心血管疾病成为威胁人类健康的巨大因素之一,而在血管钙化就是心血管病变中最为基础病理变化之一,它是导致原发病病情恶化、死亡率增加的直接因素。与血管钙化的相关疾病有动脉粥样硬化、高血压和糖尿病,尤其是慢性肾脏病(CKD)。据统计高达80%的CKD患者因血管钙化而致使心血管疾病的发生,所以血管钙化已成为全球范围内备受关注的健康问题。细胞分裂周期 42(Cell division cycle 42,Cdc42),Rho 家族的一个小 GTP酶。以往对Rho族蛋白的认识主要集中在肿瘤研究方面,Rho介导下游的一系列磷酸化-脱磷酸化反应,从而控制细胞的移动、粘附、趋化和收缩等生物学行为,而Rho族蛋白在血管钙化方面的作用尚且不是很清楚。研究目的:本文拟通过体外和体内血管钙化模型探讨细胞分裂周期42(Cell division cycle42,Cdc42)在血管钙化及血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞表型转化时相关蛋白及转录因子的变化和作用,并进一步明确Cdc42是通过AKT信号通路调节血管钙化及VSMCs向成骨样细胞表型转化。从而证明Cdc42是抑制血管钙化的潜在靶点分子,为临床上改善和逆转血管钙化所致的相关疾病提供有效的实验基础。研究方法:1.培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,待细胞长满后传代,用钙化培养基(calcifying medium,CM):含 10 mM 的 BGP 和 3 mM 的 CaCl2 的 DMEM 培养液诱导细胞钙化。采用qRT-PCR和Western blot技术检测Cdc42的表达情况,了解Cdc42在血管钙化中的变化情况,建立血管钙化体外及体内模型。2.应用腺病毒转染技术过表达Cdc42,通过预实验确定传染病毒最终浓度,根据预实验结果感染大鼠主动脉血管平滑肌细胞,采用Western blot技术检测Cdc42蛋白表达水平;采用茜素红染色技术,观察钙化情况,通过计算相对钙含量分析腺病毒过表达Cdc42对血管钙化的影响。3.雄性8周龄SD大鼠(体重220g-250g)右肾完全切除,左肾动脉结扎2/3区域。构建CKD(慢性肾脏病)模型,根据血肌酐(术后两周眼眶采血,离心取血浆,测血肌酐)进行分组,假手术组、手术模型组和Cdc42抑制剂ML141干预组。采用免疫组化石蜡切片,观察血管钙化表型的变化;通过检测相对钙含量明确钙化情况;采用qRT-PCR和Western blot技术检测不同组骨相关转录因子(BMP2、Runx2)的表达情况,进一步说明Cdc42与血管钙化的关系。研究结果:1.通过构建血管钙化体外、体内模型,观察到与普通培养基(Growth medium,GM)组相比,钙化培养基(Calcifying medium,CM)组血管平滑肌细胞Cdc42的表达水平明显上调(P<0.05);动物体内实验也表明了,手术模型组(model)Cdc42蛋白的表达水平相比Sham组也是呈现升高趋势的(P<0.01)。2.应用腺病毒过表达Cdc42,观察血管钙化表型的变化。可见茜素红染色结果与相对钙含量测定与病毒阴性对照组相比均呈现增高趋势(P<0.05);检测骨相关转录因子(BMP2、Runx2)表达水平也是上升的(P<0.05)。3.使用Cdc42抑制剂ML141干预体外、体内模型,观察到含有Cdc42抑制剂ML141的钙化实验组,对比于不含有Cdc42抑制剂ML141的钙化实验组,茜素红染色及相对钙含量检测结果均为降低(P<0.01);骨相关转录因子(BMP2、Runx2)表达水平在含有Cdc42抑制剂ML141的钙化实验组中更低(P<0.05)。在血管环实验中上述结果得到了进一步的证明。4.通过不同实验模型及实验方法,检测AKT的表达水平,表明AKT的表达水平与Cdc42呈正相关,提示Cdc42可能是通过激活AKT信号通路来促进血管钙化的。5.应用AKT抑制剂,观察血管钙化表型的变化,来验证AKT信号通路在血管钙化过程中的作用。研究结论:1、高钙和高磷酸盐可以明显地上调VSMCs和CKD大鼠中Cdc42表达水平。2、过表达Cdc42可以促进VSMCs钙化。3、抑制Cdc42可以减轻VSMCs及CKD大鼠血管钙化。4、AKT信号介导了 Cdc42诱导的血管钙化。