恶性肿瘤中，肺癌的发病率和致死率已经越来越高。目前已有文献报道，Wnt通路的失调与肿瘤的发生和发展密切相关。Disheveled蛋白(Dv1)是Wnt信号通路中位于上游的一个效应分子，是经典Wnt/β-catenin通路、非经典Wnt(PCP)通路和Wnt/Ca2+通路的重要调节因子。　　 dNKD(Naked Cuticle Drosophila)首次被发现是在果蝇体内，其基因的突变能诱发果蝇分节运动的缺失。此后，NKD1和NKD2作为哺乳动物体内Naked CuticleDrosophila的两个同系物，也相继被报道。NKD1和NKD2的基因分别位于人体染色体16q12.1和5p15.3。两者在整个氨基酸序列上存有43.8％的高度同源。NKD1含有470个氨基酸序列，它在胞浆通过其EF-Hand区域与Dv1结合，从而抑制了经典的Wnt通路。有文献报道，NKD抑制了经典的Wnt通路，却激活了PCP通路，在信号转导中发挥着重要的作用。有人在直肠腺癌和肝母细胞瘤中发现，NKD1的mRNA水平要明显高于正常组织。NKD1的基因是经典Wnt通路的下游靶基因之一，受经典通路的调控。在体内可能存在一种负反馈的机制调节着NKD1的水平。然而具体的机制不是很清楚。　　 尽管有关NKD1是如何发挥生物学功能已有一些报道，但NKD1与肿瘤的关系目前报道较少。NKD1在NSCLC中的的表达及其与临床病理因素之间的关系尚无文献报道。本实验检测了非小细胞肺癌中NKD1的表达情况及其临床意义，并在肺癌细胞系中干扰了NKD1的表达，观察对肺癌细胞系侵袭能力的影响。　　 材料与方法：　　 一、患者信息和样本　　 100例非小细胞肺癌标本来自中国医科大学附属第一临床医院病理科存档蜡块。术前均未接受化疗或放射治疗。患者的平均年龄是58岁。根据WHO组织学分类标准，腺癌67例，鳞癌33例。根据2009年国际抗癌联盟TNM分期标准，Ⅰ期24例，Ⅱ期20例，Ⅲ期44例，Ⅳ期12例。另外还有66例具有完整的随访资料。　　 另收集35对新鲜的肺癌组织及相对应的周围正常的肺组织，保存在-70℃箱内，用于提取蛋白质和RNA。　　 二、免疫组织化学　　 所有的组织块经中性甲醛固定，石蜡包埋，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫组化法进行染色。一抗使用兔源性的NKD1(1:100，santa cruz biotechnology)抗体4℃孵育过夜。以PBS代替一抗作为阴性对照。生物素标记的二抗37℃孵育30分钟，DAB显色。　　 三、免疫组化结果判定标准　　 每张切片×400倍下随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞。根据着色细胞的百分比，NKD1的表达被划分成五个等级：0分（无着色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根据细胞着色的强度，NKD1的表达又被划分成3个等级：0分（无着色），1分（浅黄色颗粒），2分（深黄色或者黄褐色颗粒）。每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数，将二者相乘，所得的乘积即为该切片的最终得分。　　 根据35例正常的支气管上皮染色后，其得分均大于3分。据此，我们将大于或者等于3分的计为正常表达，而小于3分的计为低表达。　　 四、RT-PCR和Real-TimePCR　　 细胞或者剪碎的组织利用Trizol试剂(Invitrogen)裂解，然后按照说明书的步骤，提取总的RNA。我们使用AMVVer3.0(Takara，Shiga, Japan)试剂盒。PCR产物通过2％的琼脂糖凝胶电泳，采用Bio-Imaging System进行灰度值测定，以MMP7/β-Actin作为相对表达量。Real-Time PCR实验的引物有Takara生物制剂公司设计合成，使用SYBR Green试剂盒，以β-Actin作为内参。并用Stratagene MxPro软件分析RNA的相对表达量。　　 五、免疫印迹分析　　 组织或细胞采用RIPA裂解液进行充分裂解，然后提取总蛋白，取100微克的总蛋白通过10％浓度的SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳，然后转印到PVDF膜上。1％脱脂奶粉封闭2小时，一抗NKDⅠ(1:200，Santa Cruz)，NKDⅡ(1:500，Cell Signaling)，β-Actin(1：500)4°过夜。山羊抗兔二抗37℃孵育2小时。ECL发光后，Bio-Image system进行条带灰度值测定，以NKD1/β-Actin的比值作为相对表达量。实验重复三次进行。　　 六、细胞培养和转染　　 HBE细胞系从中科院细胞库获得。LH7和BE1是来自zhengjie教授的友好惠赠。肺鳞癌LK和腺癌LTEP购自美国生物学公司。细胞系均用含有10％小牛血清和100U/mL青链霉素的1640培养基培养，并将其置于5％浓度的CO2细胞培养箱中培养。　　 细胞接种在24孔板内，24小时候后以60ng/mL的NKD1 siRNA(SC-93414，购买于santa cruz公司)，采用Lipo2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)脂质体介导的方法进行转染，转染48小时后进行检测。　　 七、细胞基质胶侵袭实验　　 以双无的1640培养基按照1：3的比例稀释基质胶(BD Biosciences)，铺在8微米孔径的上室。以100微升含有5×105个的细胞密度接种在上室。下室放含有10％小牛血清的培养基。种植后培养48小时后，甲醇固定15分钟，苏木素染色。随机选取10个视野，计数侵袭到小室下的细胞数。实验重复三次，取均值。　　 八、统计学分析　　 所有的数据采用SPSS13.0版本进行统计学分析。采用Chis-Square检验NKD1表达与临床病理因素之间的关联。采用t检验检测Westem Blot和RT-PCR结果中的灰度值。采用Kaplan-Meier法检测NKD1对患者生存时间的影响。Cox回归模型用以研究不同的变量对患者生存的影响。P＜0.05作为有统计学意义。　　 结果：　　 1、肺癌组织中NKD1蛋白表达下调，而mRNA表达上调　　 我们从35对肺癌及癌旁正常的肺组织中提取的总蛋白，Western Blot检测结果发现，肺癌中NKD1的蛋白水平要明显低于周围肺组织(P=0.009)。　　 接着我们在三种细胞系中进一步进行了验证。结果显示，正常的支气管上皮细胞系HBE的NKD1蛋白表达量明显高于两种肺癌细胞系BE1（侵袭力较高的）和LH7(侵袭能力相对低一些)，并且高侵袭力的BE1比LH7中的NKD1蛋白水平更低。　　 细胞系中的结果提示我们，NKD1蛋白的表达水平可能与肺癌细胞的侵袭能力有关。但Real-Time PCR的检测结果却表明，NKD1mRNA在肺癌中的表达量要明显高于癌旁正常肺组织，并且我们在三种细胞系中也得到了同样的结果。　　 2、NKD1蛋白的表达下调与肺癌的临床病理因素和不良预后相关　　 我们将35例正常的支气管上皮组织切片进行染色，免疫组化评估结果显示，其得分值均大于或者等于3分，将其作为正常表达。然而，在100例非小细胞肺癌的组化结果中，有78例(78％)的表现为低表达，22例(22％)为正常表达。　　 我们采用了SPSS软件分析了低表达的NKD1和肺癌的临床病理因素之间的联系，结果发现：低表达的NKD1与肺癌的组织类型(P=0.003)，低分化(P=0.004)，高TNM分期(P=0.002)，淋巴结转(P=0.013)相关，采用Kaplan-Meier生存分析也发现NKD1低表达的肺癌患者其预后生存时间要明显低于正常表达的肺癌患者(P=0.03)。并且Cox风险模型分析结果表明，NKD1蛋白是影响肺癌患者预后的一个危险因素之一(P=0.017)。　　 3、NKD1的蛋白下调可以上调Dishevelled-1,β-Catenin的蛋白表达，并增强了MMP-7基因的转录和肺癌细胞系的侵袭能力　　 采用siRNA技术下调NKD1的蛋白表达后，发现肺癌细胞系中Dishevelled-1和β-Catenin的蛋白水平随之上调。为了检测NKD1对肺癌细胞系侵袭能力的影响，下调NKD1的蛋白表达后，进行基质胶侵袭实验，结果发现：干扰NKD1后，肺癌细胞系LTEP和LK的侵袭能力均增强。然而干扰的同时孵育Dishevelled-1的特异性抗体后，细胞的侵袭能力发生了下调。　　 紧接着，我们检测了经典的Wnt信号通路下游靶基因MMP-7的转录水平，结果发现：下调NKD1的蛋白表达后，MMP-7基因的转录水平增加，并且这一上调受Dishevelled-1的影响。　　 结论：　　 1、肺癌组织中NKD1的蛋白表达下调，而mRNA表达上调。　　 2、NKD1蛋白的表达下调与肺癌的临床病理因素和不良预后相关。　　 3、NKD1的蛋白下调可以上调Dishevelled-1，β-catenin的蛋白表达，并增强了MMP-7基因的转录和肺癌细胞系的侵袭能力。