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背景： 磺酰脲类降糖药是目前非胰岛素依赖型糖尿病治疗中主要使用的降糖药之一，虽然应用广泛，但其降糖疗效和毒副作用呈现明显的个体差异给临床应用带来困扰和风险。OATP1B1、OATP1B3的基因多态性会影响转运体的功能活性，CYP2C9的基因多态性也会导致酶的活性改变这是导致用药个体差异的重要原因。已经证实格列美脲、格列苯脲和格列吡嗪是CYP2C9的底物，同时我们实验室前期研究表明格列美脲是OATP1B1转运摄取底物，格列苯脲和格列吡嗪是OATP1B3转运摄取底物。那么格列美脲、格列苯脲和格列吡嗪在体内的转运与代谢可能受其基因多态的影响，从而导致疗效和毒副作用的个体差异出现。本课题研究目的在于探究转运体OATP1B1/1B3和代谢酶CYP2C9的基因多态性对格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪的转运代谢之间的影响机制，为磺酰脲类降糖药物能够在临床上得以更合理有效安全的应用从而为实现个体化用药提供理论基础和实验依据。 目的： 通过建立CYP2C9*1、*2、*3重组酶模型和稳定高表达的OATP1B1*1a、*5、*15以及OATP1B3、OATP1B3（344T>G）、OATP1B3(699G>A)的重组质粒模型。系统研究重组酶CYP2C9和转运体OATP1B1/1B3的基因多态性对格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪转运代谢的影响。探究格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪在临床治疗上产生个体差异的转运代谢方面的分子学机制。 方法： 1.建立CYP2C9对格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪代谢的孵育体系，并建立其LC-MS检测方法。 2.建立不同基因型CYP2C9重组酶对格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪的酶促动力学分析方法。实验分为CYP2C9*1(野生型)、CYP2C9*2、CYP2C9*3组同时每组设置空白对照，每组体系中含2μL药物，0.4 mg/ml重组酶，孵育30min后加入100μL冰乙腈终止反应后处理样品。LC-MS定量检测孵育体系中样品的剩余浓度，比较其在不同突变位点的CYP2C9重组酶中酶促动力学参数Vmax、Km、Clint的差异。 3.建立HEK293T细胞的培养方法并建立细胞中格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪的LC-MS检测方法，细胞样品的处理采用乙酸乙酯萃取法。 4.在MTT检测药物对细胞毒性的基础上研究格列美脲在OATP1B1*1a-HEK293T、OATP1B1*5-HEK293T及OATP1B1*15-HEK293T细胞中的转运实验同时设置阴性空白质粒细胞组。考察细胞在系列时间（2、5、10、15、20、30 min）和系列底物浓度（2.5、5、10、20、40、80μM）对格列美脲摄取过程的影响。研究格列苯脲和格列吡嗪在 OATP1B3、及344T>G和699G>A突变位点的HEK293T细胞中的转运实验。实验分为空白对照组、OATP1B3、344T>G和699G>A质粒组。考察细胞在系列时间（2、5、10、15、20、30 min）和系列底物浓度（2.5、5、10、20、40、80μM）对格列苯脲和格列吡嗪摄取过程的影响。比较在不同基因型OATP1B1-HEK293T细胞中格列美脲的摄取动力学参数Vmax、Km、Clint。比较不同基因型OATP1B3-HEK293T细胞模型中格列苯脲、格列吡嗪的摄取动力学参数Vmax、Km、Clint。 结果： 1.本实验所建立的LC-MS分析方法用于测定代谢酶孵育体系及 HEK293T细胞样品中格列美脲、格列苯脲、格列吡嗪，专属性强、精密度高、稳定性好，符合生物样本分析的相关要求。 2.格列美脲（1、2、5、10、20、40、80μM）在野生型CYP2C9*1重组酶孵育体系中酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为2.97±1.18μM、21.58±7.78 nmol/min/mg protein、7.45±3.02μL/min/mg proteins；在突变型CYP2C9*2酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.06±1.76μM、15.69±5.95 nmol/min/mg protein、4.11±1.57μL/min/mg proteins，在突变型CYP2C9*3酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.70±2.34μM、9.17±3.03 nmol/min/mg protein、2.42±1.48μL/min/mg proteins。格列美脲在突变型CYP2C9*2，*3重组酶中的代谢活性显著低于野生型。 3.格列苯脲（1、2、5、10、20、40、80μM）在野生型CYP2C9*1重组酶孵育体系中酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.17±1.02μM、1.58±0.71 nmol/min/mg protein、0.45±0.12μL/min/mg proteins；在突变型CYP2C9*2酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.46±1.56μM、0.69±0.25 nmol/min/mg protein、0.20±0.17μL/min/mg proteins，在突变型CYP2C9*3酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.90±2.34μM、0.41±0.13 nmol/min/mg protein、0.12±0.08μL/min/mg proteins。格列苯脲在突变型CYP2C9*2，*3重组酶中的代谢活性显著低于野生型。 4.格列吡嗪（1、2、5、10、20、40、80μM）在野生型CYP2C9*1重组酶孵育体系中酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.07±1.31μM、8.82±2.78nmol/min/mg protein、2.95±1.61μL/min/mg proteins；在突变型CYP2C9*2酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为3.51±1.76μM、5.99±1.95 nmol/min/mg protein、1.69±0.47μL/min/mg proteins，在突变型CYP2C9*3酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为4.10±2.66μM、2.87±1.03 nmol/min/mg protein、0.72±0.48μL/min/mg proteins。格列吡嗪在突变型CYP2C9*2，*3重组酶中的代谢活性显著低于野生型。 5.格列美脲在OATP1B1*1a-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为7.20±1.35μM、155.0±8.72 pmol/min/mg protein、21.63±5.84μL/min/mg proteins。在OATP1B1*5-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为11.32±2.71μM、80.5±9.61 pmol/min/mg protein、7.95±2.46μL/min/mg proteins；而在OATP1B1*15-HEK293T细胞摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为10.90±3.75μM、84.56±8.20 pmol/min/mg protein、8.24±1.80μL/min/mg proteins。与野生型OATP1B1*1a-HEK293T相比，突变型OATP1B1*5，*15-HEK293T细胞中格列美脲摄取的Km明显增大。Vmax和CLint显著降低（P＜0.01）；提示格列美脲在突变型OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*15-HEK293T细胞中的摄取能力比野生型OATP1B1*1a-HEK293T明显减弱。 6.格列苯脲在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为18.91±5.31μM、44.91±7.97pmol/min/mg protein、2.39±1.06μL/min/mg proteins。在OATP1B3（344T>G）-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为21.55±3.06μM、46.08±8.69 pmol/min/mg protein、2.13±0.84μL/min/mg proteins；而在OATP1B3(699G>A)-HEK293T细胞摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为25.91±6.79μM、37.31±5.04 pmol/min/mg protein、1.51±0.70μL/min/(mg proteins)。与野生型OATP1B3-HEK293T相比，突变型OATP1B3(344T>G)-HEK293T细胞中格列苯脲摄取的K、V和CL均无差异；但在OATP1B3(699G>A)-HEK293T细胞Km比野生型高，Vmax和CLint要低于野生型（P＜0.05）。提示格列苯脲在突变型OATP1B3(699G>A)-HEK293T细胞中的摄取能力比野生型OATP1B3-HEK293T低。 7.格列吡嗪在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为28.02±6.91μM、16.50±3.64 pmol/min/mg protein、0.59±0.16μL/min/mg proteins。在OATP1B3（344T>G）-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为30.52±5.36μM、16.87±4.23pmol/min/mg protein、0.55±0.24μL/min/mg proteins；而在OATP1B3(699G>A)-HEK293T细胞摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为33.55±6.63μM、13.42±2.79 pmol/min/mg protein、0.38±0.17μL/min/mg proteins。与野生型OATP1B3-HEK293T相比，突变型OATP1B3(344T>G)-HEK293T细胞中格列苯脲摄取的Km、Vmax和CLint均无差异；在OATP1B3(699G>A)-HEK293T细胞Km与野生型无差异，但是Vmax和CLint要低于野生型（P＜0.05）。提示格列吡嗪在突变型OATP1B3(699G>A)-HEK293T细胞中的摄取量比野生型OATP1B3-HEK293T低。 结论： 1.格列美脲、格列苯脲与格列吡嗪在突变型CYP2C9*2、*3重组酶的代谢速率显著低于在野生型CYP2C9*1中。 2.格列美脲可被OATP1B1*1a、*5、*15-HEK293T细胞摄取。与野生型OATP1B1*1a-HEK293T相比，格列美脲在突变型OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*15-HEK293T细胞中的转运摄取明显减少。 3.格列苯脲、格列吡嗪可被OATP1B3、OATP1B3（344T>G）和OATP1B3（699G>A）-HEK293T细胞摄取。与野生型OATP1B3-HEK293T细胞相比，格列苯脲、格列吡嗪在突变型699G>A中的转运活性下降，而在突变型344T>G中的转运活性不受影响。