血吸虫病作为一种人畜共患病,可导致患者在感染晚期发生肝硬化。目前临床上尚无特效的抗纤维化治疗方案,因此,发现新的防治肝纤维化途径具有重要意义。血吸虫病肝纤维化其本质是一种免疫病理性疾病,由血吸虫虫卵分泌的可溶性抗原（soluble egg antigen,SEA）诱导的虫卵肉芽肿病变及继发纤维化。形成肉芽肿反应的主要细胞包括中性粒细胞（neutrophil）、巨噬细胞（macrophage,Mφ）、肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）,B 细胞和 T 细胞。白介素 33（interleukin,IL-33）作为IL-1家族的一种新成员,研究报道,IL-33参与四氯化氮（carbon tetrachloride,CCL4）诱导的纤维化模型,但IL-33在日本血吸虫病肝肉芽肿和纤维化过程中的作用机理尚未阐明。已知T细胞共刺激信号配体（inducible T-cell costimulatory ligand,ICOSL）在Mφ上表达,ICOSL/ICOS信号是否可特异性调控Mφ（M1/M2）极化发挥不同功能效应状态,从而影响日本血吸虫病虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理变化?ICOSL/ICOS信号通路是否能够影响Mφ极化状态调控IL-33表达参与日本血吸虫病虫卵肉芽肿病理改变和肝脏纤维化进程?这些科学问题均值得深入探讨。此外,近年来研究证实microRNAs（miRNAs）也是参与不同类型的肝脏纤维化形成的重要因子,特别是miR-130a-3p在肝纤维化形成中的作用得到了研究者的日益关注,其在血吸虫病肝纤维化中的功能有待进一步阐明。本项研究通过构建日本血吸虫病感染ICOSL基因敲除（knock-out,ICOSL-KO）小鼠模型,体内外实验研究相结合,通过体内实验观察特异性下调ICOSL/ICOS信号后调控Mφp极化影响IL-33分泌表达及与肝纤维化发展的相关性;体外实验探讨IL-33对Mφ极化以及HSCs活化、自噬和凋亡的影响,深入阐明其作用机制。此外,本项研究通过体内外实验探讨miR-130a-3p对日本血吸虫病肝脏Mφ和HSCs的调控以及对肝纤维化的影响,以期从不同角度探索调控血吸虫病肝纤维化进程的潜在靶点及有效途径。本研究旨在从ICOSL/ICOS信号及miR-130a-3p不同视角,以血吸虫病免疫病理中的关键细胞Mφ和HSCs作为重要靶细胞,为进一步阐明血吸虫病肝脏免疫病理机制提供新的科学依据,研究结果可为晚期肝纤维化的防治策略提供新的思路。第一部分ICOSL/ICOS信号调控M(φ向M1极化诱导HSCs活化介导小鼠血吸虫病肝纤维化的分子机制一、IL-33调节HSCs功能对小鼠血吸虫病肝脏免疫病理的影响目的:探讨日本血吸虫病小鼠不同病期IL-33变化趋势及对HSCs作用。方法:应用 H＆E（Hematoxylin-eosin staining）和 Masson 染色,观察日本血吸虫感染前以及感染早期（4周）、感染急性期（8周）和感染慢性期（12周）肝脏虫卵肉芽肿病变和肝脏纤维化程度的病理变化趋势;应用实时荧光定量PCR（Quantitative real time PCR,qRT-PCR）检测纤维化相关因子变化以及IL-33在感染小鼠不同病期表达水平;分离血吸虫感染急性期的原代HSCs,应用免疫荧光检测IL-33受体（Suppression of Tumorigenicity 2,ST2）的表达,并应用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和 TUNEL 染色以及 qRT-PCR 分析 IL-33 对 HSCs 凋亡、活化的影响。结果:通过观察肝脏组织病理切片（H＆E和Masson染色）可发现,日本血吸虫病感染小鼠在感染第4周出现肝脏肉芽肿病变,感染第8周肉芽肿面积最大（55.50±9.70）,纤维化形成;qRT-PCR结果显示α平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,胶原（collagen,Col）I,转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β）,IL-4,IL-13和IL-33在血吸虫感染4周开始表达增高并于第8周达到峰值,随后逐渐下降;免疫荧光结果显示ST2在活化的HSCs上表达;FCM和TUNEL染色结果表明IL-33可抑制HSCs的凋亡;qRT-PCR结果发现IL-33可促进HSCs的活化,诱导HSCs中α-SMA和Col I的表达。结论:日本血吸虫感染小鼠,IL-33动态变化水平与肝脏肉芽肿病变和纤维化程度的变化呈正相关（r=0.993,P=0.007）,提示IL-33参与了日本血吸虫病肝脏的免疫病理过程。本研究发现IL-33的受体ST2可以表达于活化的HSCs,激活IL-33/ST2通路,对HSCs的凋亡产生抑制作用,而对HSCs的活化起促进效应。二、ICOSL-KO小鼠血吸虫病中Mφ向M1型极化减轻肝纤维化目的:探讨ICOSL/ICOS信号调控日本血吸虫感染小鼠Mφ极化调节肝脏肉芽肿和纤维化的发生发展。方法:WT型和ICOSL-KO小鼠日本血吸虫感染前以及感染4周、8周和12周,分别留取标本。应用H＆E和Masson染色检测肝脏肉芽肿病变和纤维化程度;应用免疫组化（immunohistochemical,IHC）检测肝脏α-SMA,IL-33和ST2的表达水平;通过碱裂解法和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测肝脏羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）和血清透明质酸（Serum hyaluronic acid,HA）表达水平;通过qRT-PCR检测肝脏纤维化相关因子变化;通过FCM分析肝脏Mφ上巨噬细胞甘露糖受体（Macrophage mannose receptor,CD）86（M1）和CD206（M2）表达水平;通过qRT-PCR检测肝脏Mφ上诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitic oxide synthase,iNOS）和精氨酸酶（arginase,Arg）1和IL-33的表达水平,应用免疫荧光和FCM观测IL-33在Mφ的表达,并检测IL-33刺激后Mφ的CD206表达水平。结果:H＆E、Masson染色和qRT-PCR结果显示,与对照组野生型（Wild type,WT型）小鼠相比,ICOSL-KO小鼠在日本血吸虫感染4周、8周和12周肉芽肿面积和纤维化程度以及纤维化相关因子表达水平均显著下降。免疫组化（immunohistochemical,IHC）结果显示,与 WT 型小鼠相比,ICOSL-KO 小鼠 IL-33和ST2表达量明显下降。免疫荧光和FCM结果说明Mφ表达IL-33,且IL-33能促进Mφ向M2型活化。FCM和qRT-PCR检测结果显示,与WT型小鼠相比,ICOSL-KO小鼠Mφ从感染后4周开始,CD86的表达水平显著上调（p＜0.001）,而CD206的表达显著下调（p＜0.001）。相较于WT小鼠,ICOSL-KO小鼠Mφ上IL-33的表达水平显著下降。结论:ICOSL-KO小鼠在血吸虫感染病程中促进Mφ向M1型偏移,减少IL-33的表达从而减轻日本血吸虫病肝脏的免疫病理进程。提示特异性下调ICOSL/ICOS可促进Mφ向M1型极化,分泌的IL-33减少,可以重塑血吸虫病肝脏的内环境,有效减轻肝纤维化。三、ICOSL-KO小鼠体内干预IL-33/ST2信号对血吸虫病肝纤维化的影响目的:探讨体内干预IL-33/ST2信号对ICOSL-KO小鼠感染血吸虫病急性期肝脏纤维化的免疫调节作用。方法:本实验随机将20只ICOSL-KO小鼠分为2组接受不同干预,组Ⅰ（ICOSL-KO组）和组Ⅱ（ICOSL-KO加rIL-33体内干预组）,两组小鼠分别用日本血吸虫尾蚴感染建立肝纤维化模型,组Ⅱ小鼠在尾蚴感染后1周腹腔注射1 μg rIL-33,每周一次,共注射4次,组Ⅰ和组Ⅱ小鼠在感染6周、8周和10周留取肝脏和血清检测。应用H＆E和Masson染色检测肝脏肉芽肿和纤维化程度;通过碱裂解法和ELISA检测肝脏的HYP和血清的HA表达水平;应用FCM检测不同类型Mφ上Ly6C的表达水平以及脾淋巴细胞中IL-4和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达水平;应用qRT-PCR检测趋化因子（C-C motif配体2,CCL2）、CCL5和趋化因子（C-X-C motif配体2,CXCL2）的表达;应用IHC检测肝脏ERK,Smad2/3和TGF-β的表达量;体外用rIL-33刺激JS1细胞,应用FCM和蛋白免疫印迹（Western Blotting,WB）检测JS1凋亡率和自噬情况。结果:H＆E和Masson染色结果显示,与组Ⅰ小鼠相比,组Ⅱ（ICOSL-KO小鼠加IL-33体内干预组）小鼠在感染6周、8周和10周肉芽肿面积和纤维化程度显著增加;FCM结果发现组Ⅱ小鼠在感染6周时大量枯否细胞（Kuffer cells,KCs）和单核细胞浸润至肝脏,且Ly6Chi型Mφ显著增高;组Ⅱ小鼠在感染第8周脾淋巴细胞IL-4的表达量显著上调,而TNF-α的表达水平从感染6周开始显著下降;qRT-PCR检测结果发现CCL2,CCL5和CXCL2的变化趋势与Ly6Chi的变化趋势一致;IHC检测组Ⅱ小鼠肝脏ERK,Smad2/3和TGF-β的表达水平显著上调;FCM和WB结果显示JS1细胞加IL-33刺激后,凋亡率显著下降,自噬显著增加。结论:在ICOSL-KO小鼠感染日本血吸虫病模型中,IL-33可促进Mφ向Ly6Chi表型极化,诱导Th细胞向Th2型极化,通过TGF-β/Smad2/3和ERK信号促进HSCs自噬和活化,抑制其凋亡,加重了血吸虫病肝脏纤维化程度。第二部分miR-130a-3p作为新免疫卡控点调控Mφ极化及抑制HSCs活化介导小鼠血吸虫病肝纤维化的分子机制目的:已有研究发现microRNAs（miRNAs）在临床上多种肝硬化疾病中发挥重要作用,本部分研究拟探讨miR-130a-3p在血吸虫病肝纤维化中的生物学功能。方法:提取乙肝型肝硬化病人血清和血吸虫感染8周小鼠的肝脏,应用qRT-PCR检测miR-130a-3p的表达水平。血吸虫尾蚴感染小鼠后,通过尾静脉注慢病毒载体（lentivirus,LV）-miR-130a-3p或LV-NC,应用小动物活体成像检测慢病毒的分布情况。在血吸虫感染小鼠8周时,应用H＆E和Masson染色统计小鼠肝脏肉芽肿病变和纤维化程度;应用IHC和qRT-PCR检测α-SMA和Col I等纤维化指标;应用FCM检测不同组Mφ CD206（M2）和Ly6Chi表达情况;应用qRT-PCR检测不同Mφ上基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）,基质金属蛋白酶抑制剂 1（Tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1）以及趋化因子CCL2,CXCL2,CCL3和CCL4的表达水平。用miR-130a-3p的类似物及对照AgomiR-1 30a-3p/AgomiR-NC 和 miR-130a-3p 的抑制物及对照AntagomiR-130a-3p/AntagomiR-NC转染JS1细胞,应用FCM和细胞增殖毒性试剂盒（Cell Counting Kit 8,CCK8）观察miR-130a-3p对JS1活化、增殖和凋亡和影响。分别使用维恩图、WB、qRT-PCR和双荧光素报告基因预测和验证miR-130a-3p的靶基因。结果:qRT-PCR结果显示,miR-130a-3p在肝硬化患者的血清和日本血吸虫感染小鼠的肝脏中表达显著降低。小动物活体成像观察到LV-miR-130a-3p可有效进入肝脏,H＆E和Masson染色结果说明LV-miR-130a-3p减轻肝脏肉芽肿炎症和胶原沉积。同时,FCM和qRT-PCR结果显示LV-miR-130a-3p诱导Mφ呈现Ly6Clo表型,TIMP1表达下调,MMP 2表达上调,促进胶原溶解。FCM和CCK8及qRT-PCR结果发现过表达miR-130a-3p不仅可以抑制HSCs的激活和增殖,还可以诱导HSCs的凋亡。此外,维恩图、WB、qRT-PCR和双荧光素报告基因证实miR-130a-3p 能与丝裂原活化蛋白激酶 1（Mitogen activated protein kinase 1,MAPK1）、转化生长因子受体 1（Transforming growth factor receptor 1,TGFBR1）和TGFBR2基因结合,并抑制这些基因的表达。结论:本研究结果表明miR-130a-3p通过与靶基因MAPK1,TGFBR1和TGFBR2结合,促进Mφ向Ly6Clo表型偏移,促进HSCs凋亡并抑制其活化和增殖从而减轻肝脏纤维化。