背景强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis,AS）是一种由免疫介导的慢性炎症性风湿病,可以引起炎症性背痛,影响脊柱和骶髂关节,导致患者生活质量下降,给个人和社会带来沉重的负担。炎症和新骨形成是AS的主要特征,在过去的10年里,高通量技术的进展和涉及大样本的队列研究使得AS在新的遗传关联和免疫通路方面取得了相当大的进展;几种炎症途径的发现促使AS进入生物制剂时代,为AS的治疗提供新的选择。尽管取得了这些进展,但该疾病背后的发病机制尚未被完全了解,对现有治疗的反应,不同患者存在较大的个体差异,因此,探索AS的发病机制,可能有助于发现影响AS疾病进展尤其是新骨形成的新的特异性生物标志物,从而可能为AS的病情评估或治疗提供新的思路。RNA结合蛋白（RNA-binding proteins,RBPs）是基因表达的重要效应因子,对各种RNA的不同生物学进程中均起到调控作用,在炎症和免疫调节中有着重要的生物学功能,并在多种风湿病的发生发展中起着重要作用。本研究通过转录组测序方法,筛选出AS患者与健康对照组之间的差异表达RBPs,探讨目标RBP在AS患者中的表达情况,临床价值及潜在的生物学功能和作用机制。方法1.通过RNA测序（RNA-sequencing,RNA-seq）的方法,将5例AS患者和3例正常人全血细胞中的差异表达基因与RBPs总表取交集（overlap分析）,获得差异表达RBPs,通过对这些RBPs进行功能富集分析,选择在AS患者中表达一致且与健康成人表达差异显著、GO和KEGG富集在炎症或成骨相关通路的RBP作为目标RBP。2.利用qRT-PCR验证RIO激酶3（RIO kinase 3,RIOK3）在AS患者和正常对照组的差异表达情况,收集入组患者的一般临床资料,对患者的疾病功能指标、疾病活动性指标和影像学指标进行评估,比较不同疾病活动状态、结构损伤程度时RIOK3的表达差异,采用相关分析、线性回归以及单因素和多因素logistic回归模型分析RIOK3与AS临床指标的相关性,探讨其临床价值。3.通过siRNA对小鼠骨髓间充质干细胞（mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBMSCs）中的RIOK3进行了敲低,采用RNA-seq技术对siRIOK3 mBMSCs进行转录组学研究,包括基因差异表达分析、功能注释、GO和KEGG分析,获得RIOK3影响的下游差异表达基因。4.根据获得的siRIOK3 mBMSCs RNA-seq数据,选择转录水平差异显著并与成骨分化通路密切相关的基因,采用qRT-PCR检测siRIOK3 mBMSCs中所选基因的表达水平,进一步验证RIOK3对成骨分化通路相关基因的调控作用。5.通过GEO数据库下载转录组数据集GSE113844,主要包括mBMSC成骨分化诱导前和诱导后3天的转录组数据,将该转录组数据与mBMSCs中siRIOK3数据整合,进一步挖掘RIOK3对mBMSCs成骨分化的影响作用。6.通过慢病毒转染构建稳定敲低RIOK3的mBMSCs细胞系,使用CCK-8方法检测敲低RIOK3对细胞增殖的影响,成骨诱导21天后通过茜素红染色观察钙沉积,并在0天、7天、14天通过qRT-PCR检测成骨标志性基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）和骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的mRNA表达水平的变化,以研究敲低RIOK3对mBMSCs成骨分化功能的影响。结果1.高通量测序技术检测出AS患者和正常对照组样本共1103个差异表达基因,包括676个上调基因和427个下调基因,这些差异表达基因与1542个RBPs基因总表取交集,筛选出20个AS差异表达RBPs,综合基因差异表达情况、富集分析以及文献调研结果,筛选出RIOK3作为目标RBP。2.qRT-PCR验证及临床分析结果:（1）RIOK3在AS患者中的表达显著高于正常对照组（P＜0.05）,在伴有骨桥AS患者中的表达水平高于无骨桥的患者（P＜0.05）;在不同结构损伤状态下,骶髂关节MRI存在骨髓水肿和脊柱伴有骨桥的AS患者中表达水平更高（P＜0.05）。（2）Spearman相关性分析结果显示:RIOK3水平与疾病活动指标（CRP、ASDAScrp评分）和结构损伤指标（骨桥形成、SPARCC评分、m SASSS评分）之间存在相关性（P＜0.05）（3）回归分析:在以m SASSS评分为因变量的线性回归分析中,RIOK3、年龄、ESR与X线分级均被纳入线性模型,RIOK3（β=0.363,P=0.018）与m SASSS评分呈正相关;在以SPARCC评分为因变量的线性回归分析中,RIOK3、性别、枕墙距、BASFI、m SASSS评分均被纳入线性模型,RIOK3（β=0.440,P=0.003）与SPARCC评分呈正相关;单因素和多因素logistic回归分析发现,RIOK3、年龄、骶髂关节X线分级是骨桥形成的危险因素（P＜0.05）,基于logistic回归分析结果,建立AS患者骨桥形成的列线图预测模型,该模型C指数为0.909（95%CI 0.820-0.999）,校准曲线贴合度较高,且P值＞0.05,具有高度准确性和良好的拟合度。3.在mBMSCs中敲低RIOK3后会抑制转录、核糖体功能相关基因的表达,尤其是成骨分化相关的转录因子,同时还会影响β-干扰素相关通路基因的表达,以及与AS炎症及病理骨形成密切相关的信号通路白细胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）通路和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）通路基因的表达。qRT-PCR结果显示:siRIOK3的mBMSCs中成骨分化相关的转录因子HMGA2、HIF1A、JUN、SOX4,干扰素通路基因IFIT1、IFI202b、IFI204、IFI203以及IL-17和TNFα显著下调表达（P＜0.001）。4.将mBMSC成骨分化诱导前后的转录组数据与mBMSC中si-RIOK3数据的整合,结果显示RIOK3敲低效应主要和成骨分化中的炎症反应相关通路基因共表达,KEGG则主要富集在HIF-1信号通路、MAPK信号通路。5.敲低RIOK3会显著抑制mBMSCs的增殖和成骨分化。成骨诱导第21天,敲低RIOK3（KD-RIOK3）组茜素红染色未见明显骨结节形成;成骨诱导第7天、14天,KD-RIOK3组ALP和OPN基因转录水平较NC组均明显降低,第7天两组OCN基因的转录水平无明显差异,而到第14天,KD-RIOK3组显著低于NC组（P＜0.05）。结论1.RIOK3富集在干扰素相关通路和固有免疫相关通路,是重要的免疫调控因子,能影响核糖体的功能。2.RIOK3在AS患者中上调表达,与疾病活动和结构损伤指标相关,是骨桥形成的危险因素之一,有望成为AS患者骨桥形成的有效预测因子。3.敲低RIOK3会抑制mBMSCs中与转录、核糖体功能相关基因的表达,尤其是成骨分化相关的转录因子,还会抑制β-干扰素相关通路基因、IL-17通路和TNF-a通路基因的表达。4.RIOK3敲低效应主要和mBMSCs成骨分化中的HIF-1信号通路、MAPK信号通路以及炎症反应相关通路基因共表达。5.敲低RIOK3会抑制mBMSCs增殖和成骨分化,并通过抑制成骨标志性基因ALP、OCN、OPN基因的表达而影响mBMSCs的成骨分化过程。